马链球菌兽疫亚种表面蛋白FIPP的免疫效力评价

【目的】评价马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus,SEZ)表面蛋白FIPP(纤维蛋白原和Ig结合蛋白前体)的免疫效力,为预防SEZ感染提供新的候选疫苗抗原。【方法】根据NCBI数据库公布的FIPP基因序列设计引物进行PCR扩增,将扩增片段克隆到原核表达载体pColdⅠ,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,FIPP蛋白通过IPTG诱导在大肠杆菌中表达及纯化,以SDS-PAGE进行鉴定。纯化后的重组蛋白FIPP(rFIPP)对BALB/c小鼠进行免疫,二免14 d后对小鼠进行免疫保护试验并采集血清;解剖感染SEZ小鼠的肝脏、脾脏和肺脏进行病理组织学观察。以酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测小鼠血清中的特异性抗体IgG水平,以蛋白质印迹(Western blotting)方法检测重组蛋白的反应原性,通过全血杀菌试验检测血清的杀菌活性。【结果】通过SDS-PAGE电泳可观察到约96 k D的蛋白片段,与FIPP蛋白的理论分子量相符。重组蛋白rFIPP免疫小鼠后对SEZ攻击的保护率达70.0%。ELISA方法检测结果表明,重组蛋白rFIPP免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体免疫球蛋白G(IgG),且极显著高于阴性对照(P<0.01,下同),通过IgG亚型分析,发现IgG1的抗体水平显著高于IgG2a(P<0.05),说明重组蛋白rFIPP免疫后产生的抗体亚型以IgG1为主。全血杀菌试验结果表明,重组蛋白rFIPP超免血清对SEZ具有极显著杀灭作用。组织病理学观察结果显示,重组蛋白rFIPP免疫后能有效减弱小鼠各类器官的病理损伤。【结论】经表达纯化的重组蛋白rFIPP在小鼠感染SEZ模型中具有良好的免疫保护效力,可用作制备SEZ亚单位疫苗的有效候选抗原。

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析

猪圆环病毒2型(PCV2)常与马链球菌兽疫亚种(SEZ)混合感染。为构建表达PCV2 Cap蛋白的重组SEZ并分析其免疫原性,本研究通过PCR扩增PCV2 Cap基因和SEZ疫苗株ST171 Szp基因的上下游同源臂基因(Szp-up、Szp-down),将上述PCR产物分别与pMD19-T载体连接,分别构建重组质粒pMD19-T-Cap、pMD19-T-Szp-up和pMD19-T-Szp-down。将pMD19-T-Szp-up与pG+host5分别双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp-up;将pMD19-T-Szp-down与pG+host5-Szp-up分别经双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp。上述重组质粒均经酶切和测序鉴定正确后分别经BamH I酶切pG+host5-Szp载体和pMD19-T-Cap载体后构建重组载体pG+host5-PCV2-Cap-Szp,并使PCV2 Cap基因替换Szp基因的166 bp~783 bp。经酶切和测序鉴定正确后将该质粒电转化ST171感受态细胞,通过红霉素抗性板筛选重组SEZ PCV2-Cap-Szp/ST171株。通过菌落计数分别绘制PCV2-Cap-Szp/ST171及其亲本菌株ST171的生长曲线;分别采用荧光定量PCR(qPCR)检测重组菌株Cap基因以及亲本菌株ST171 Szp基因的转录水平;通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定重组菌株Cap蛋白的表达。结果显示,亲本菌株和重组菌株的生长曲线基本一致,重组菌株中Cap基因的转录水平与亲本菌株中Szp基因的转录水平相当,且其中的蛋白肽段与PCV2 Cap蛋白的肽段相符,表明插入Szp基因不影响ST171的生长特性,且重组菌中的Cap基因可以正常转录并能够表达Cap蛋白。分别经小鼠腹腔接种不同剂量的重组菌株及亲本菌株,并采用改良寇氏法(Karber氏法)计算两株菌对小鼠的半数致死量(LD50)。结果显示,重组菌株及亲本菌株对小鼠的LD50分别为3.21×108 cfu/mL及2.0×10^(7) cfu/mL,虽然前者对小鼠的LD50有所升高,但其对小鼠的致病性并未增强。将重组菌株及亲本菌株灭活乳化后与商品化的PCV2灭活疫苗分别免疫小鼠,0.5 mL/只,二免后14 d采用间接ELISA检测各组小鼠血清中的Cap蛋白抗体水平,结果显示,免疫亲本菌株及PBS对照小鼠均未产生PCV2 Cap蛋白特异性抗体,而重组菌株刺激小鼠产生的Cap蛋白抗体水平极显著高于PCV2商品化疫苗(P<0.001)。将上述3株菌按照上述方法分别经腹腔免疫小鼠。二免后14 d经腹腔以0.5 mL 1×106 cfu/mL的SEZ C55138株攻击,观察记录小鼠的死亡情况,并绘制生存曲线;将重组菌株和亲本菌株按照上述方法免疫小鼠,二免14 d后经腹腔接种0.2 mL 1×108拷贝/mL的PCV2。分别于攻毒后不同时间采血,采用qPCR检测各组小鼠血清中的病毒载量。SEZ C55138株攻毒结果显示,免疫ST171与PCV2-Cap-Szp/ST171的小鼠均未出现临床症状和死亡,存活率达100%;而两个阴性对照组小鼠攻菌后均表现出相应临床症状,并相继死亡,死亡率分别为70%和80%。PCV2攻毒实验结果显示,与免疫ST171组小鼠相比,免疫重组菌株的小鼠在攻击PCV2后1 d、3 d和5 d小鼠血清中的病毒载量均有所降低。上述结果表明,本实验构建的重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171能够诱导免疫小鼠产生高水平的体液免疫反应,并保护小鼠免受致病性SEZ的伤害及减少PCV2攻毒后小鼠血清中的病毒载量,本研究为细菌活载体疫苗及PCV2和SEZ二联疫苗的研发奠定基础。

马链球菌兽疫亚种SclE蛋白原核表达;及其免疫效力评价

【目的】探究马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ)表面蛋白SclE的免疫效力,为预防SEZ引起的链球菌病提供理论依据。【方法】采用PCR扩增SEZ的SclE基因,再将该片段克隆至原核表达pCold I载体上,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后以SDS-PAGE进行分析鉴定,获得的重组蛋白SclE(rSclE)(100μg/mL,0.5 mL)以腹腔注射形式免疫BALB/c小鼠(n=10,一免、二免的周期均为14 d)。一免、二免14 d后收集血清,通过ELISA和Western blotting检测抗体水平和特异性。二免后进行免疫保护试验,并对攻毒后小鼠的肝、脾、肺、肾进行细菌载量检测和病理组织学观察。【结果】SDS-PAGE检测到大小约为93 kD的蛋白表达,与SclE的理论分子量大小一致;Western blotting检测显示,表达所得重组蛋白能与SEZ阳性对照组(腹腔注射0.5 mL SEZ灭活疫苗)小鼠血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。ELISA检测显示,二免后小鼠血清中特异性抗体水平与一免后相比均有显著提升(P<0.05,下同),且可诱导小鼠产生高滴度的IgG,其中IgG1抗体水平(0.436±0.031)显著高于IgG2a(0.161±0.009),表明rSclE诱导的抗体亚型以IgG1为主;rSclE免疫小鼠可显著抑制SEZ在各脏器中的增殖能力,肝脏、脾脏出血及炎性细胞浸润的症状得到改善,肺脏和肾脏出血等病理损伤减轻;在小鼠免疫攻毒保护试验中保护70%小鼠免受致死剂量SEZ毒株的攻击。【结论】成功表达获得的rSclE能诱导小鼠产生SclE特异性抗体,且具有较好的保护效果,可作为一种SEZ潜在的疫苗候选抗原。

猪肌肉多发性脓肿病原菌的分离鉴定及药敏试验

广东某大型养殖场在生猪屠宰过程中,发现一体征无异常,但全身肌肉出现多发性脓肿的病例。本试验对病灶的脓汁进行了细菌分离、培养、鉴定及药敏试验,并对感染部位进行了病理学分析。菌落形态学观察、革兰染色镜检、生化试验和16S rDNA基因序列分析结果显示,该猪肌肉多发性脓肿病原菌为巴氏葡萄球菌;药敏试验结果显示,分离菌株对青霉素、万古霉素、林可霉素等多种常见抗菌药耐药;病理切片结果显示,脓肿病灶中有大量的炎症细胞浸润。本试验为诊断此类猪肌肉多发性脓肿病提供了科学依据,为辨别同类病例提供了临床经验。

2015-2018年广东省猪流行性腹泻病毒M基因的遗传进化分析

本试验通过对22株采集于2015-2018年广东省内猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株的M基因进行克隆和测序,并将测序结果与NCBI中PEDV参考株M基因进行同源性分析和构建系统进化树,从而了解广东省PEDV流行株的近年来遗传变异情况。结果显示,22株PEDV流行株间核苷酸序列同源性为97.5%~100.0%,与华南地区参考株M基因核苷酸序列同源性为97.7%~99.9%,与国内较早分离株CH/S和经典毒株CV777同源性较低,分别为97.5%~98.1%、97.7%~98.2%。PEDV M基因遗传进化分析显示,22株广东PEDV流行株的同源性较高,亲缘关系紧密,此外,22株广东PEDV流行株与大部分代表性毒株、疫苗株亲缘关系较远,如国内早期分离株CH/S、经典毒株CV777、韩国株KRPEDV-9-Vaccine、泰国株MNIAH10054108、日本株JMe2、英国株Brl/87等。试验结果表明,广东省当前的PEDV流行毒株存在基因变异并形成独特进化分支。

一例犬髌骨脱位的诊治

1只3岁雄性贵宾犬,体重3 kg,因后肢跛行就诊,采用血常规、血液生化指标检查及直接数字化X射线摄影系统(DR)检查,诊断为双侧后肢髌骨内侧脱位,Ⅲ级。对患犬进行滑车沟加深术治疗,通过DR检查确认髌骨复位成功,患犬术后第7天拆线,10 d后可正常行走。说明髌骨脱位采取滑车沟加深术治疗具有良好的效果。