作物基因工程湖南省重点实验室建设与管理的实践与思考

以当前作物基因工程湖南省重点实验室建设的现状为基础,根据学校实际情况,确定了实验室建设与发展的目标,总结了自实行首席科学家制以来取得的成效。并就如何能使实验室的建设和管理更科学、更规范,提出了一些看法。

分子标记辅助选择Pigm基因改良水稻不育系桃农1A的苗瘟抗性

为了改良桃农1B和桃农1A的苗瘟抗性,以携带广谱持久抗稻瘟病基因Pigm的中国地方水稻品种谷梅4号为供体亲本,先后以三系保持系桃农1B及其不育系桃农1A为受体亲本,利用与Pigm紧密连锁共显性DNA标记T9E3开展辅助选择育种。T9E3在桃农1B或桃农1A基因组中的PCR扩增条带约为2 000 bp,而对谷梅4号基因组的扩增产物大小为926 bp,多态性稳定;采用来自国内外不同稻区的32份稻瘟菌菌株室内接种苗瘟,桃农1B和桃农1A抗性频率均为9.38%,谷梅4号与改良系抗性频率均为90.63%;田间天然病圃鉴定桃农1B和桃农1A苗瘟8级,而改良系和供体亲本谷梅4号苗瘟均为0级。通过T9E3辅助选择、田间病圃筛选和室内接种鉴定,初步获得了3份高抗稻瘟病的改良不育系(桃农1A-Pigm-1—桃农1A-Pigm-3)及其保持系(桃农1B-Pigm-1—桃农1B-Pigm-3),进一步通过不育特性、农艺性状与产量结构调查分析,从中遴选出1个高抗稻瘟病、不育性稳定、包颈率低、农艺产量性状优良的优异不育系桃农1A-Pigm-2及其配套保持系桃农1B-Pigm-2。桃农1A-Pigm-2不育度和不育株率均为100%,典败花粉约占60%、圆败花粉约占40%,柱头外露率高达71.1%,包颈粒率仅为33.6%;桃农1B-Pigm-2播始历期为69 d,株高76.2 cm,主穗穗长28.1 cm,单株有效穗数15.8穗,单穗总颖花数115.3个,千粒质量27.7 g。实现了桃农1A和桃农1B苗瘟抗性及其他性状的综合改良,为三系杂交水稻育种应用创制了新的亲本材料。

Bt毒蛋白基因与植物抗虫基因工程

Ｂｔ毒蛋白基因与植物抗虫基因工程林良斌官春云（作物基因工程湖南省重点实验室，湖南农业大学长沙４１０１２８）在世界范围内，害虫造成的损失约占农作物总收获量的１３％，每年大约损失数千亿美元。目前，防治害虫仍然是主要地使用化学农药，但随着时间推移，由此而引...

基因工程技术在花卉中的应用

近年来花卉产业得到了蓬勃发展,不断成熟的基因工程技术为花卉的品质改良提供了新的思路,也为花卉产业化发展带来了新的机遇。本文综述了影响植物花色、花型、花期等相关基因及转基因的研究,展望了基因工程技术在花卉育种和产业化应用的发展前景。

基因工程技术在棉花品种改良中的应用

综述了基因工程技术在棉花品种改良中的应用，特别是转Ｂｔ基因抗虫棉的研究和发展概况，并探讨了目前存在的问题及展望．

马铃薯转基因工程研究现状

随着生物技术的高速发展和基因工程的日益完善,在马铃薯育种中利用转基因技术来改良品种特性,提高作物抗病虫害的能力,增加生物产量,将会更为直接便捷地解决常规育种无法解决的问题。综述了近十年来转基因工程在马铃薯育种上的应用,为马铃薯产业的大力发展提供理论依据。

分子标记辅助选择Pi9基因改良水稻不育系桃农1A稻瘟病抗性

以籼稻品系75-1-127为广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的供体亲本,先后以三系保持系桃农1B及其不育系桃农1A为受体亲本,利用Pi9基因内共显性InDel标记CoInDF_(1)R_(2)开展MAS回交育种以定向改良桃农1A稻瘟病抗性。分子标记CoInDF_(1)R_(2)在75-1-127基因组中扩增出1条大小为354 bp的条带,而在桃农1B和桃农1A基因组中扩增条带大小约为470 bp。分别以75-1-127与CO39作为抗病对照与感病对照进行室内人工接种,得到桃农1A、桃农1B及其改良不育系和保持系的抗菌谱,结果显示,75-1-127的抗性频率为86.67%,桃农1A与桃农1B的抗性频率均为6.67%,而改良不育系桃农1A-Pi9及其保持系桃农1B-Pi9的抗性频率同75-1-127,且田间病圃表现高抗苗瘟。经田间不育特性、农艺性状与产量结构调查分析,育成1个高抗稻瘟病、不育性彻底且稳定、柱头外露率高、包颈粒率低、农艺产量性状优良的新不育系桃农1A-Pi9-1及其配套保持系桃农1B-Pi9-1,实现了桃农1A稻瘟病抗性的定向改良。

Pi9基因标记辅助选择改良水稻不育系金23A稻瘟病抗性

以携带广谱持久的抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75–1–127为供体亲本,以保持系金23B及其不育系金23A为受体亲本,采用Pi9基因共显性标记CoInDF1R2进行MAS回交育种,以改良三系不育系金23A及其保持系金23B的稻瘟病抗性;用25份稻瘟菌代表性菌株进行室内苗瘟接种,观察苗瘟抗性表现。结果显示:金23A和金23B的抗性频率仅为28%,而75–1–127的抗性频率为92%;田间病圃抗性鉴定结果显示,75–1–127高抗苗瘟,而金23A和金23B受体亲本均高感苗瘟;共显性标记CoInDF1R2在75–1–127基因组上扩增出大小为354 bp的PCR产物,对金23A或金23B基因组的扩增产物大小约470 bp,说明该标记在2个亲本间的多态性明显且稳定;利用CoInDF1R2开展连续多年MAS回交育种实践,培育出了农艺性状优良、丰产性较好的抗病不育系金23A–Pi9–1及抗病保持系金23B–Pi9–1,为三系法杂种优势利用提供了新的抗稻瘟病亲本材料。

水稻DUF760基因家族的全基因组鉴定与表达谱分析

为了探索DUF760基因家族在水稻生长发育中的潜在功能,对水稻DUF760基因家族进行了全基因组鉴定、分类、启动子序列分析和表达谱分析。通过生物信息学技术在水稻和拟南芥中分别鉴定了6,8个DUF760家族成员。系统进化树分析将这些家族成员分成2个亚家族,二者在蛋白保守基序和基因结构上也存在一些特征差别。水稻DUF760家族基因启动子区域存在多个响应逆境胁迫和植物激素的顺式作用元件,ABRE(脱落酸响应)元件存在于家族所有成员的启动子序列中,OsDUF760-1启动子区域拥有9个脱落酸(ABA)相关的响应元件。在ABA处理水稻后,OsDUF760-1的转录表达水平显著下调,而OsDUF760-3显著上调,二者在干旱胁迫处理水稻后的表达变化模式与ABA处理水稻后的表达变化模式一致,说明这2个基因可能通过ABA信号途径参与水稻干旱胁迫响应,并且扮演不同的角色。除对ABA和干旱胁迫处理具有较强响应外,水稻DUF760家族成员还对JA(茉莉素)、低温及稻瘟菌处理具有较强的响应表达变化。

根癌农杆菌介导TA29-Barnase基因转化甘蓝型油菜的研究

经比较影响农杆菌介导Barnase嵌合基因转化甘蓝型油菜的各种因素后 ,建立了高效稳定的转基因实验体系。按该体系 ,甘蓝型油菜“湘油 15”子叶柄预培养 2 0h ,OD60 0 为 0 5农杆菌菌液感染后共培养 3d ,在MS +2mg·L-1AgNO3 +4 5mg·L-1BA +10mg·L-1Km +30 0mg·L-1Carb培养基上进行选择 ,转化率为 8 8% ,PCR检测和Southern杂交检测证明外源基因已整合了甘蓝型油菜基因组中。

甘蓝型油菜FAD2基因cDNA片段的克隆和序列分析

为了提高油菜的油酸含量 ,继而培育高油酸油菜品种 ,从甘蓝型油菜成熟叶片中分离总 RNA,经反转录合成 c DNA第一条链 ,以此为模板进行多聚酶链式反应 ,产物为一长 6 5 4 bp的 DNA片段 .经克隆和序列测定表明 ,其核苷酸序列与 Gen Bank中甘蓝型油菜 FAD2基因在比较区的同源性达 10 0 % .

转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究

通过对转 Bt杀虫蛋白基因油菜植株的后代进行卡那霉素抗性分析和 PCR技术检测 ,结果表明 :Bt杀虫蛋白基因是以单拷贝、杂合地整合到转基因植株 (T0 1、T0 2、T0 3、T0 5、T0 6、T0 7、T0 8)的基因组中 ,并稳定地遗传。EL ISA检测表明 :在第 3～第 9叶期 Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中高效地表达 ,Bt杀虫蛋白的表达量为 170～ 2 6 0 ng/ 2 5mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 6 7%～ 0 .10 5 % ,其抗虫效果高达 72 .0 %～ 94 .4 %。但从第 11叶期后 Bt杀虫蛋白表达量显著地降低 ,只有 7～ 5 0 ng/ 2 5 mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 0 3%～ 0 .0 2 %。

基因枪法向甘蓝型油菜转移反义FAD2基因的研究

为了获得高油酸油菜品种,以湘油15号子叶柄为受体材料,用基因枪法,将反义油酸脱饱和酶FAD2基因连在种子特异表达载体上后导入油菜,使用可裂膜压力7700kPa,样品室真空度9.5×104Pa,质粒质量浓度为1.0μg/μL,靶距9cm,通过对子叶柄的预处理48h,高渗处理1h,获得8株再生植株.经PCR与PCR-Southern杂交检测,其中有2株为转化株,证明反义FAD2基因已整合到湘油15号基因组中.

利用Pi9基因序列标记辅助选择改良籼稻稻瘟病抗性

利用广谱抗稻瘟病基因Pi9基因序列设计的特异分子标记Pi9–a,通过回交育种和分子标记辅助选择技术,改良8份受体水稻材料(丰源B、Ⅱ32B、天龙香103、香丰187、明恢63、轮回422、R747、25H003)的稻瘟病抗性。结果表明:分子标记Pi9–a对8份受体亲本与Pi9供体亲本75–1–127间进行的多态性检测中,除香丰187外,其余7个组合间均存在稳定明显的多态;对4个BC1F1群体进行随机取样的基因型和表型鉴定中,Pi9–a对抗稻瘟病表型选择的效率均为100%。

植物GPATs基因研究进展

甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)是三酰甘油(Triacylglycerol,TAG)生物合成的限速酶,催化TAG生物合成的起始步骤。GPATs主要负责将脂肪酰基从酰基-酰基载体蛋白(acyl-ACP)或酰基辅酶A(acyl-CoA)上转移到甘油-3-磷酸的(Glycerol-3-phosphate,G3P)sn-1位置上。有些成员还具有sn-2酰基转移活性。目前已经在多种植物中克隆得到了GPAT基因。这些GPAT基因编码的酶主要分为三类,它们在细胞中分别定位于质体、线粒体和内质网上。这些酶参与三酰甘油、几丁质和软木脂等多种脂质的生物合成,在植物的生长发育中发挥着非常重要的作用。文章介绍了植物GPAT基因的染色体定位和基因结构以及GPAT酶的亚细胞定位、sn-2酰基转移特异性、GPAT酶的底物选择性及其生理功能的最新研究进展。

甘蓝型油菜fad2基因片段的克隆和反义表达载体的构建

从甘蓝型油菜湘油 15号基因组中分离总DNA ,以此为模板进行多聚酶链式反应 (PCR)。PCR产物与克隆载体 pGEM -TEasy连接 ,经NotI酶切后插入 pBluescriptIISK +。序列测定表明 ,PCR产物为 6 5 4bp的DNA片段 ,fad2基因片段只朝 pBluescriptIISK +的T3-T7方向插入 ,经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI12 1相同的酶切位点 ,构建反义 fad2表达载体。

根癌农杆菌介导反义ACC合成酶基因对枣树的转化

以枣树鲜食品种鸡蛋枣为材料,通过根癌农杆菌介导ACC合成酶反义基因转化,得到了转基因植株.预培养1d的枣树幼嫩茎段经根癌农杆菌感染后共培养3d,转移至分化选择培养基MS(1/2NO3)+0.15mg/LNAA+1.75mg/LZT+10mg/LKm+500mg/LCarb上诱导产生不定芽,将抗Km不定芽先后在15mg/LKm的生长、增殖和生根培养基上继续选择,诱导成完整植株.经PCR检测从抗Km植株中选择到7株阳性植株,进一步经Southern杂交证实有6株外源基因已整合到了枣树基因组中.Real timePCR定量检测表明,ACC合成酶反义基因在5株转基因植株中得到表达.

亚麻4CL基因克隆及RNAi遗传转化

该实验以前期克隆的亚麻4CL基因片段为靶序列,利用RACE方法克隆其全长cDNA序列(1 957bp),GenBank登录号为KC832864,该序列含有1 650bp完整的开放阅读框。系统进化树分析表明,亚麻4CL基因与盐芥4CL基因亲缘关系较近,而与禾本科的水稻(Oryza sativa)等亲缘关系最远。其编码蛋白预测分析结果显示,亚麻4CL基因由549个氨基酸组成,相对分子量为60kD,等电点为5.3,蛋白质二级结构以无规则卷曲比例最多,其次是α-螺旋。以亚麻4CL基因编码区413bp靶标序列作为干扰区段,扩增其正反向基因片段,构建植物干扰表达载体p1301M-4CL。通过农杆菌介导转入亚麻,DNA及RNA水平上分子检测发现,RNAi结构已经转入亚麻中,并显著降低了其4CL基因的表达量。

用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(CT)15与亚麻基因组DNA酶切片段杂交,捕获300～1500bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用接头引物和根据微卫星核心序列设计的引物VRV(CT)15使用PCR方法直接对文库筛选,从422个转化子中获得了104个阳性克隆,对其进行测序分析,获得了97个微卫星序列,微卫星序列的富集效率达到22.99%,PCR扩增筛选效率93.27%。对97个微卫星序列进行比对分析,其中51个重复序列的两端序列高度相似,据其设计的特异引物对阳性克隆进行2次筛选,能淘汰相似度高的同类序列,提高筛选亚麻微卫星标记的效率。

水稻抗稻瘟病基因的定位与克隆研究进展

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是一种真菌性病害,又名稻热病,是水稻最主要的病害之一,它是水稻生产的主要限制因子之一,对世界水稻生产和粮食安全带来了极大的影响。克隆和利用稻瘟病基因被认为是最为经济、有效和环保的策略。该文主要就近年来水稻抗稻瘟病基因定位与克隆以及抗瘟基因的分子结构特点等方面取得的研究进展进行了综述,同时对抗瘟基因在水稻抗病育种中的应用提出了展望。