皮层肌动结合蛋白不同位点磷酸化对人气道上皮细胞黏蛋白5AC分泌的影响

目的:了解皮层肌动结合蛋白(cortical actin-binding protein,又称cortactin)在人气道上皮细胞黏蛋白(mucin,MUC)5AC分泌中的作用及不同磷酸化位点对其的影响。方法:培养人气道上皮细胞HBE16,以皮层肌动结合蛋白不同磷酸化位点突变载体转染细胞,并分为空白对照组、剪应力刺激组、剪应力+增强绿色荧光蛋白质粒(enhanced greenfluorescentproteinplasmid,p EGFP)-N1组、剪应力+p EGFP-N1-cortactin(Cort)组、剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y421A组、剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y470A组及剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y486A组,剪应力设定为4 dynes/cm^2。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、real-time PCR法测定转染前后各组细胞及培养上清中MUC5AC蛋白和m RNA水平,Western印迹检测各组皮层肌动结合蛋白及磷酸化皮层肌动结合蛋白含量;异硫氰酸荧光素(fl uorescein isothiocyanate,FITC)标记的鬼笔环肽染色观察丝状肌动蛋白(fi lamentous actin,F-actin)的分布情况。结果:4 dynes/cm^2剪应力刺激30 min后,细胞中磷酸化皮层肌动结合蛋白表达增加,在2 h时表达水平最高;剪应力刺激2 h后,MUC5AC m RNA表达增强,细胞及培养上清中MUC5AC的含量与空白对照组相比,各组均显著增加(均P<0.05);与剪应力刺激组相比,剪应力+p EGFP-N1-cortactin(Cort)组的细胞培养上清液中MUC5AC蛋白含量显著增加,F-actin在胞膜的分布也明显增多(均P<0.05),而胞质内MUC5AC蛋白及MUC5AC m RNA水平变化不大。与剪应力+p EGFP-N1-Cort组相比,剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y421A组、剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y470A组培养上清液中的MUC5AC蛋白含量有明显降低,F-actin在胞膜的聚集也有所减少(均P<0.05),而剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y486A组中MUC5AC含量变化不明显(P>0.05)。结论:皮层肌动结合蛋白参与了剪应力诱导产生的人气道上皮细胞MUC5AC蛋白分泌,Tyr421和Tyr470位点磷酸化在其中可能起重要的作用。