拉布拉多犬X/Y精子分选及性别控制冷冻精液制备实验研究

目的探讨流式细胞分选技术在分离拉布拉多犬X、Y精子方面的应用，并研究拉布拉多犬性别控制（性控）冷冻精液的制备方法。方法人工按摩刺激法采集8只拉布拉多种公犬精液，利用SX_MOFLO流式细胞仪展开X、Y精子分离实验，并对分离后的X／Y精子冷冻、解冻后进行精液重分析和品质鉴定。结果流式细胞仪分选的X／Y精子纯度达到89％以上（89％～91％），X精子平均分离速度（4260个／s）极显著高于Y精子分离速度（3930个／s）（P〈0．01）；常规冷冻精液和X、Y型冷冻精液性别比差异显著（P〈0．05）；冻融后活率则无明显差异（P〉0．05）；常规冷冻精液与X、Y型冷冻精液解冻后1h存活指数差异明显（P〈0．05），分别为0．251±0．006、0．054±0．007和0．048±0．006；冻融后顶体完整率差异显著（P〈0．05），分别为77．00％±0．98％、84．66％±1．22％和84．01％±1．23％。结论用流式细胞分选技术可以获得高纯度的拉布拉多犬X／Y冷冻精液，性别比和精液品质达到低剂量人工授精的要求。

基于Sequenom MassARRAY SNP技术检测嗅觉受体基因与工作犬嗅探能力的关联性研究

目的开展嗅觉受体基因(OR)的单核苷酸多态性(SNP)与工作犬嗅探能力之间的关联性研究。方法应用Sequenom MassARRAY SNP技术,对OR基因的单核苷酸多态性(SNP)位点进行检测,并分析不同SNP基因型与工作犬嗅探能力之间的关联性。结果建立的Sequenom MassARRAY SNP检测OR基因分型技术方法,68个SNP位点在史宾格犬、拉布拉多犬和德国牧羊犬3个犬种中检出率在90%以上;显示与工作犬的嗅探能力呈一般统计学意义上显著相关(P<0.05)的SNP位点有23个,但经过多重检验bonferroni (BONF)法和FDR_BH法校正后,表明COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364和CfOR0055_265这4个SNP位点与嗅探能力分别呈显著相关(P<0.05)和极显著相关(P<0.01)。结论筛选出显著影响工作犬嗅探能力的主效OR基因SNP位点4个,初步建立了一种适用于史宾格犬、拉布拉多犬和德国牧羊犬这3个工作犬种,鉴定其嗅探能力的分子遗传学检测方法。

犬体内唾液酸受体的组织分布及对H3N2亚型犬流感病毒的易感性研究

目的测定犬体不同组织器官内流感病毒受体的类型和分布差异,验证犬对H3N2亚型犬流感病毒的易感性。方法采集健康英国史宾格犬的不同组织器官,利用凝集素免疫荧光组织染色方法,检测组织内人型流感病毒唾液酸受体唾液酸α2,6-半乳糖(SAα2,6Gal)和禽型流感病毒唾液酸受体唾液酸α2,3-半乳糖(SAα2,3Gal)类型与分布;用H3N2亚型犬流感病毒人工感染英国史宾格犬,采集不同组织器官,用免疫组织化学染色法进行病毒的组织分布差异性分析。结果多种组织器官中同时存在着SAα2,6Gal和SAα2,3Gal两种类型的受体,少数组织器官中存在单一受体;SAα-2,6Gal受体在分布的广泛性、在同一器官中的表达量上高于SAα-2,3Gal型受体。人工感染后,病毒分布量与受体量整体趋势基本一致,仅在个别器官中存在差别。结论禽型和人型流感病毒受体广泛分布于犬的各个组织器官,犬具备同时感染禽型和人型流感病毒的分子基础。

拉布拉多犬低剂量性控冻精的人工授精试验研究

为了评估拉布拉多犬低剂量性控冻精的人工授精效果,试验采用经流式细胞仪分离的拉布拉多犬X冻精和Y冻精,开展低剂量性控冻精的人工授精技术方法研究。结果表明:X冻精后代性别控制准确率为83.33%,Y冻精后代性别控制准确率为82.35%;自然交配母犬情期受胎率为84.00%,显著高于性控冻精母犬受胎率71.43%(P<0.05);平均窝产仔数、仔犬成活率差异均不显著(P>0.05);性控精液与自然交配所产后代初生、1月龄、2月龄、3月龄、4月龄的体重和1~4月龄的体尺差异不显著(P>0.05)。

犬热应激过程中HSP70和免疫相关细胞因子的变化

为研究热应激造成犬免疫机能损伤的机制及损伤过程中免疫相关细胞因子的变化规律,分别在夏季持续高热天气中每隔7d、分5次采集了拉布拉多犬的血清和外周血单个核细胞(PBMC),检测血清中皮质醇(COR)、热休克蛋白70(HSP70)、白细胞介素2((IL-2)和白细胞介素(IL-10)、Toll样受体2(TLR-2)和Toll样受体4(TLR-4)的含量及PBMC中HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4的mRNA的表达,并与春季非应激温度下检测的同类指标进行比较。结果显示,夏季持续高热天气中犬长期处于应激状态,其PBMC中HSP70mRNA表达上调,IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4mRNA表达下调;血清中COR浓度持续高于正常值,HSP70浓度升高,IL-2、TLR-2浓度未发生显著变化,IL-10、TLR-4浓度显著低于正常水平。热应激条件下PBMC中白介素和Toll样受体mRNA表达下调,可能是导致犬的免疫功能抑制、抗感染免疫机能下降的原因。

热应激对拉布拉多犬生理、激素、血液生化指标的影响

为研究犬热应激时的生理生化状态,并探讨以生理生化指标作为衡量犬热应激程度的可行性,分别在14、18、28、35℃测量了拉布拉多犬的生理生化指标。结果表明,犬在14℃、18℃体内指标处于正常水平,在28℃、35℃时处于热应激状态;与正常水平比较,犬在热应激时呼吸频率显著加快、血清皮质醇(COR)水平显著升高,呼吸、COR值升高与温度、温湿指数(THI)之间存在显著相关性;直肠温度、ACTH未发生显著变化;血清中的主要酶类中ALT、ASP、CK、LDH在急性热应激时显著升高,然后恢复至正常水平,GLU、ALP未发生显著变化。证明在犬热应激研究中,气温、THI、COR、呼吸频率可作为主要的参考指标;体温及血液中ACTH、GLU、ALP含量与犬热应激程度不相关;ALT、ASP、CK、LDH在不同动物热应激中的变化规律不一致,能否作为犬热应激程度的指示指标有待进一步研究。

H3N2亚型犬流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

为了快速诊断H3N2亚型犬流感病毒(CIV)感染,根据H3N2亚型CIV的M和HA基因序列,设计了3组LAMP引物,优化反应条件,建立了H3N2亚型CIV的RT-LAMP检测方法。结果表明,RT-LAMP方法能在63℃恒温条件下,在45min内完成扩增,通过反应管中预加的荧光染料颜色的变化实现目视化判定。该方法对犬的常见病原无交叉反应,具有较好特异性;灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍。该方法操作简单、快速灵敏、特异性强,适合现场应用,对H3N2亚型CIV的检测具有实际的应用价值。

犬IFN-γ的原核表达及其对A型流感病毒H3N2亚型的抑制作用

为研究犬的7干扰素（IFN-γ）对犬流感病毒H3N2亚型的抑制作用，由经ConA诱导过的健康犬淋巴细胞中特异性地扩增犬IFN-γ（cIFN-γ）基因，构建重组原核表达载体pET-cIFN-γ，转化宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达，以MDCK—VSV法对纯化后产物进行抗病毒活性鉴定，并在MDCK细胞上测定对H3N2亚型犬流感病毒的抑制作用。结果表明，表达产物以包涵体形式存在，经变性、复性、纯化后，所制备犬IFN-γ的抗病毒活性为1．1×105U／rag，重组犬IFN-γ稀释2。倍后对犬流感病毒的增殖仍具有明显抑制作用。本研究成功表达了具备抗H3N2亚型流感病毒活性的犬IFN-γ，为犬流感病毒新型药物的开发奠定了基础。

运输应激对拉布拉多犬血液皮质醇和生化指标的影响

为探讨运输对犬的影响,本试验以拉布拉多犬为实验动物,运输前和运输2 h后分别采血,应用放射免疫、生化等方法测定血液皮质醇、促肾上腺皮质激素和生化指标。结果显示,运输后皮质醇(COR)浓度和谷草转氨酶(AST)比运输前显著增高(P<0.05),肌酸激酶(CK)活性极显著增高(P<0.01),促肾上腺皮质激素(ACTH)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖(GLU)无明显差异(P>0.05)。结果表明,2 h运输可引起拉布拉多犬血液皮质醇、谷草转氨酶和肌酸激酶水平的变化。

ASIC1基因SNP_(s)检测及其与史宾格犬胆量性状的关联分析

为了研究史宾格犬酸敏感离子通道1(acid-sensing ion channel 1,ASIC1)基因的多态性及其与胆量性状之间的关系,试验采用DNA测序技术,对166只史宾格犬ASIC1基因的多态性进行研究,并利用SPSS软件中的一般线性模型(general linear model,GLM)分析了ASIC1基因与胆量性状的关系。结果表明:在ASIC1基因外显子2、外显子4和外显子5上各发现了一个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphic,SNP)位点,分别为9G>C、102A>C和20G>A;9G>C和20G>A位点属于中度多态,102A>C位点属于低度多态,且这3个位点均不符合Hardy-Weinberg平衡状态;102A>C与胆量评分显著相关(P<0.05),其中AC型和CC型胆量评分显著高于AA型(P<0.05),AC型和CC型之间差异不显著(P>0.05)。笔者发现了一个与史宾格犬胆量性状显著相关的SNP位点,其可作为史宾格犬早期胆量性状的分子标记,用于史宾格犬早期胆量性状的分子标记辅助选择。

犬β-防御素cBD103的原核表达和纯化

将犬β-防御素103(canineβ-defensin 103,cBD103)基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-cBD103,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达后,利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,并用肠激酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物。结果表明,质粒pET-cBD103经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,大肠埃希菌中成功表达出目的蛋白,蛋白大小约为24ku,以可溶性表达为主。经过纯化和酶切,得到大小8ku的cBD103,与预期大小一致。该研究在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,为下一步大规模制备cBD103奠定了基础。

基于混池测序的犬恐惧行为相关变异位点的初步筛选

为了初步筛选与犬恐惧行为相关的变异位点,对6~8月龄的犬进行严格的恐惧行为测试,根据测试结果选取恐惧行为极端差异的史宾格犬20头,分为高恐惧行为组(FBH)和低恐惧行为组(FBL),每组各10头,采用混池测序的方法检测史宾格犬全基因组的单核苷酸多态性位点(SNP)和插入缺失位点(InDel),筛选与史宾格犬恐惧行为相关的变异位点。结果显示:通过特定条件的筛选,FBH组和FBL组存在差异的SNPs共14个,InDels共2个,这16个位点位于9个基因上。研究表明,通过混池测序的方法可以初步筛选出与犬恐惧行为相关的变异位点,进一步分析确定与恐惧行为遗传效应相关的变异位点,可以为犬遗传育种改良提供理论依据。