携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞及其成脂分化

背景:胰岛素是成脂诱导剂的重要组成成分。然而胰岛素存在半衰期,会随着体内代谢不断灭活及降解,植入体内的细胞或材料无法像体外那样以更换培养液来达到目的。实验拟通过转染胰岛素基因,使转染后的干细胞稳定分泌胰岛素,促进其成脂分化。目的:探讨携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后对其成脂分化能力的影响。方法:取第3代人脐带间充质干细胞,以感染复数为20转染腺病毒载体。实验分为4组:对照组为第4代人脐带间充质干细胞;实验组1为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞;实验组2为第4代人脐带间充质干细胞+成脂诱导液;实验组3为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞+成脂诱导液。结果与结论:转染48h后实验组1和实验组3的人脐带间充质干细胞在荧光显微镜下显现弱荧光,72h后荧光较强。经脂肪诱导培养液培养14d后,实验组1,2,3油红O染色后显微镜下呈红色,对照组未见脂滴形成,实验组1可见一些细小脂滴形成;实验组3与实验组2相比,脂滴大且多,定量分析显示,实验组3油红O染色阳性的面积和吸光度大于实验组2(P<0.05)。由此说明携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后可促进其成脂能力。

CD4^+CD25^+调节性T细胞在多脏器功能障碍综合征中的变化及药物干预

目的探讨CD4^+CD25^+调节性T细胞(Treg)在多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠外周血中的变化及乌司他丁和血必净的干预效果。方法以内毒素(LPS)建立MODS模型,并以乌司他丁和血必净注射液干预。应用流式细胞仪检测Treg水平变化。结果模型组、乌司他丁组和血必净组CD4^+CD25^+Treg的百分比明显高于对照组(P<0.05或P<0.01);乌司他丁组和血必净组的水平又明显高于模型组(P<0.05或P<0.01),但二组相比无统计学差异(P>0.05)。结论 CD4^+CD25^+Treg在大鼠MODS中的百分比升高,并参与了MODS的病情调节;乌司他丁和血必净能调升CD4^+CD25^+Treg的相对含量。

转染携带人胰岛素基因慢病毒载体提高颗粒脂肪移植物存活率的实验研究

目的探讨转染携带人胰岛素基因慢病毒载体提高颗粒脂肪移植物存活率的可行性。方法将携带人胰岛素基因慢病毒载体转染后的人脐带人间充质干细胞(hUCMSCs)与人颗粒脂肪复合分为3组:A组[移植颗粒脂肪1 mL+0.4 mL达尔伯克(氏)必需基本培养基(DMEM)],B组[颗粒脂肪1 mL+0.4 mL DMEM+2×10~5 hUCMSCs(CM-Dil标记)],C组[颗粒脂肪1 mL+0.4 mL DMEM+2×10~5hUCMSCs(CM-Dil标记+转染)]。使用2 mL注射器接16号针头注射到Wistar大鼠背部皮下。3月后,每组取6只沿被膜分离移植物,取样行湿重测定,HE、马松三色染色,荧光观察。结果 C组湿重、血管数均高于A、B组(P<0.05),存活率(移植后脂肪湿重/移植前脂肪湿重)高于A、B组(P<0.05)。结论将携带重组人胰岛素慢病毒载体转染后的hUCMSCs与脂肪颗粒复合移植能提高颗粒脂肪移植成活率。

银屑病伴发多发Bowen病及鳞状细胞癌1例

患者女,50岁。周身反复出现鳞屑性红斑伴瘙痒30年,右臀出现菜花状肿物1年。有银屑病病史30年,予UVA照射治疗70余次。手术切除右臀肿物,组织病理示鳞状细胞癌和Bowen病。诊断:银屑病;鳞状细胞癌;Bowen病(多发)。

双基因重组腺病毒表达载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF的构建及表达

目的:构建同时携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和角质细胞生长因子(KGF)的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIFKGF),观察其在A549中的表达。方法:从低氧处理A549细胞中PCR扩增HIF-1αcDNA,并连接到载体pShuttle-CMVEGFP上得到重组质粒pShuttle-GFP-HIF,同时将从质粒pIRES2-EGFP-KGF扩增的KGF基因也克隆其上,获得穿梭重组质粒pShuttle-GFP-HIF-KGF。再将其重组到pAdxsi病毒骨架载体上,构建携带HIF-1α和KGF双基因的重组腺病毒载体。观察重组腺病毒转染A549细胞后表达情况。结果:证实携带HIF-lα和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFPHIF-KGF成功构建。其转染A549细胞后可有效表达HIF-1和KGF蛋白,48 h时HIF-1蛋白表达水平为(56.36±4.53)ng/ml,KGF蛋白表达水平为(60.20±2.92)ng/ml。结论:成功构建了双基因腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其可有效转染表达,具有进一步在肺损伤防治应用的前景。

卡泊三醇联合复方丙酸氯倍他索软膏治疗银屑病的近期疗效观察

目的探讨卡泊三醇软膏联合复方丙酸氯倍他索软膏外用治疗银屑病的近期临床疗效。方法采用随机、开放、平行自身对照试验。将符合入选标准的93例慢性斑块型银屑病患者的皮损沿躯干中线分为左右两侧,采用随机数字法决定一侧躯干及肢体皮损为治疗组,给予外用复方卡泊三醇软膏,2次/d,复方丙酸氯倍他索软膏,1次/d,4周为1个疗程,与治疗部位相对应的另一侧躯干及肢体皮损为对照组,涂用丙酸氯倍他索软膏,2次/d,他扎罗汀乳膏,1次/d,疗程同治疗组。同时给予患者口服维生素C 0.2,3次/d,叶酸10 mg,3次/d,郁金银屑片0.96,3次/d,窄谱中波紫外线治疗1次/3 d。治疗前及治疗开始后每2周评估患者的症状积分,计算患者的症状积分指数(SSRI),评价治疗效果。结果共有79例患者完成试验,治疗组D14、D28时SSRI分别为0.81±0.23与0.92±0.11,与对照组(0.53±0.17、0.64±0.23)相比差异均有统计学意义(均P<0.05);治疗组痊愈率D14为63.29%,D28为78.48%,与对照组(分别为39.24%、50.63%)相比差异有统计学意义(均P<0.05);总有效率治疗组在D14为94.94%,D28为97.47%,与对照组相比较(D14为65.82%,D28为72.15%)差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论卡泊三醇软膏联合复方丙酸氯倍他索软膏外用治疗寻常型银屑病具有肯定的疗效,未发现严重不良反应。

低氧诱导因子和角质细胞生长因子双基因重组腺病毒的构建及其在肺泡上皮细胞中的表达

目的:构建同时携带低氧诱导因子-lα(HIF-lα)和角质细胞生长因子(KGF)的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF-KGF),观察其在防治肺损伤潜在的应用前景。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA作为模板,依据GeneBank公布的HIF-1αcDNA设计引物,并分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建重组质粒pShuttle-GFP-HIF。然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板,用引入NheI和PmeI酶切位点的引物PCR扩增KGF基因并克隆到重组质粒pShuttle-GFP-HIF上,获得穿梭质粒重组质粒pShuttle-GFP-HIF-KGF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF。检测重组腺病毒滴度后,转染人肺泡上皮细胞A549,检测目的基因的转染表达。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、滴度高。用pAdxsi-GFP-HIF-KGF以100 MOI转染A549细胞后24h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48h时荧光更强;转染48h ELISA法检测培养上清中HIF-1蛋白表达水平为(56.36±4.53)ng/mL,KGF蛋白表达水平为(60.20±2.92)ng/mL。结论:成功构建了腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其转染效率及目的基因的蛋白表达水平较高,具有潜在的进一步在肺损伤局部应用的前景,为后期制备可以同时发挥KGF、HIF-1作用的基因治疗药物打下基础,同时为高海拔地区应激性急性肺损伤的有效防治提供实验基础。

非小细胞肺癌的治疗方案及影响预后的重要因素

目的:回顾分析各种非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的治疗方案及影响其治疗预后的因素,为合理制定个体化的综合治疗方案提供参考。方法:回顾分析近年来NSCLC治疗的研究报道,分析如病理分期、实验室检查结果(VEGF、WBC、Hg等)影响治疗预后的因素,建议相应的治疗对策。结果:1.Ⅰ期、Ⅱ期及部分Ⅲa期NSCLC的患者治疗措施首先以手术治疗为主,同步放化疗比单纯放、化疗及序贯放化疗更能有效改善晚期NSCLC的预后;2.个体相关因素、肿瘤相关因素和治疗相关因素影响NSCLC治疗预后。结论:同步放化疗在晚期NSCLC的治疗中有重要作用,肿瘤的病理分期、血浆VEGF浓度是影响NSCLC预后的独立因素。