应用活体生物发光成像技术研究纳米雄黄的抗小鼠恶性黑色素瘤肝肺转移作用

目的采用小动物活体成像技术研究纳米雄黄对小鼠B16-luc恶性黑色素瘤的抗转移作用和机制。方法以萤火虫荧光素酶（1uciferase，luc）基因标志小鼠B16黑色素瘤细胞（B16-luc），BALB／c小鼠的尾静脉注射B16-luc细胞制作小鼠黑色素瘤肺转移瘤模型，每日4mg／kg和8mg／kg纳米雄黄灌胃24d，阳性对照组隔日腹腔注射顺铂（DDP）2mg／kg，阴性对照组灌胃生理盐水0．02L／kg。小动物活体成像系统动态观察肿瘤细胞转移情况。治疗末期处死动物，取出肺和肝，置活体成像系统下直接成像，并肉眼观察肺和肝表面转移瘤结节形成：另对肺、肝肿瘤组织作HE染色，光镜下观察组织形态变化。结果活体成像显示纳米雄黄可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞在肺和肝中的转移（P〈0．05），解剖肉眼可见肝、肺表面转移灶显著减少或消失，病理学检查显示纳米雄黄治疗组小鼠的肺脏内转移瘤结节小、数量较少，大多数瘤结节中央呈坏死液化改变，肝脏内未见到转移瘤结节。结论纳米雄黄可有效抑制小鼠恶性黑色素瘤B16-luc细胞的肺转移和肝转移能力。

胰岛素抵抗的人肝癌细胞HepG2对多柔比星的敏感性

目的:观察胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的人肝癌细胞对抗癌药物多柔比星(adriamycin,ADM)的敏感性,并探讨其抗药机制。方法:采用5×10-6moL/L胰岛素诱导(36和48h)人肝癌细胞HepG2建立HepG2/IR细胞模型,并用盐酸吡格列酮(pioglitazone hydrochloride,PH)逆转HepG2/IR细胞的IR状态。MTT法检测HepG2/IR细胞对ADM的敏感性,FCM检测P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达水平,实时荧光定量RT-PCR检测多药耐药基因1(multiple drug resistance 1,MDR1)mRNA的表达。结果:HepG2/IR细胞对ADM的敏感性降低(P<0.05),MDR1 mRNA的表达量分别是HepG2细胞的1.62倍(胰岛素诱导36h)和5.21倍(胰岛素诱导48h),P-gp蛋白的阳性表达率分别提高了47.50%(胰岛素诱导36h)和189.05%(胰岛素诱导48h)。PH可逆转HepG2/IR细胞MDR1/P-gp的表达增加以及逆转细胞对ADM的抗药性。结论:胰岛素诱导的人肝癌细胞HepG2/IR可通过增加MDR1/P-gp的表达,使细胞对抗癌药物产生抗药性。

三氧化二砷经内质网应激反应诱导K562/ADM耐药细胞凋亡

目的探讨三氧化二砷(As2O3)能否通过内质网应激反应性凋亡途径诱发耐药白血病细胞凋亡。方法采用细胞形态学和AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡,电镜观察凋亡细胞内质网和线粒体形态结构变化;流式细胞术(FCM)测定线粒体跨膜电位(Δψm)、细胞内Ca2+和细胞色素c(Cyt c)含量及caspase-3活性;Western blot法检测GRP78/Bip蛋白表达。结果2、5μmol/L As2O3诱导K562/ADM细胞发生凋亡过程中,内质网明显扩张和脱颗粒,线粒体内外膜融合,嵴紊乱,肿胀,内膜扩张呈空泡样变。线粒体Δψm降低,细胞质Ca2+和Cyt c水平明显升高,caspase-3活性显著增强,GRP78蛋白表达增高。结论As2O3可诱导K562/ADM细胞发生内质网应激反应,通过内质网-线粒体途径诱导耐药白血病K562/ADM细胞凋亡。

胰岛素抵抗肝细胞多药耐药基因1的表达

目的体外观察诱导发生胰岛素抵抗(IR)肝细胞中多药耐药基因1(mdr1)的表达。方法采用高浓度胰岛素诱导肝源性细胞HepG2建立IR细胞模型(HepG2/IR细胞),GOD-POD微量化法测定葡萄糖消耗量,RT-PCR检测HepG2/IR细胞mdr1和胰岛素受体(InsR)基因mRNA的表达,流式细胞术检测P糖蛋白(P-gp)和InsR蛋白水平。结果HepG2/IR细胞葡萄糖消耗量降低10%～45%,InsR基因mRNA表达显著下调,受体表达量降低50.2%～82.9%;mdr1表达显著增强,mRNA转录增高0.7～2.1倍,P-gp表达阳性细胞增加0.6～1.7倍,表达强度增高。结论IR肝细胞mdr1和P-gp的表达显著增强。

自噬对三氧化二砷所致正常淋巴细胞损伤的保护效应

目的研究三氧化二砷(As2O3)致外周血淋巴细胞(PBL)损伤中自噬与凋亡的作用。方法应用密度梯度离心法从正常人外周血中分离淋巴细胞,MTT法检测细胞增殖活性;Annexin-V/PI双标记染色检测凋亡;电镜观察细胞形态学改变;单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色观察细胞自噬水平;流式细胞术(FCM)检测Bcl-2的表达水平。结果 1.0~8.0μmol/L As2O3呈剂量、时间依赖性地抑制人PBL增殖和诱导凋亡,24 h和48 h的IC50分别为12.46μmol/L和3.76μmol/L,并可诱导细胞发生自噬活化。用3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制细胞自噬可增强As2O3对PBL的抑制效应,24 h和48 h的IC50分别为10.40μmol/L和2.31μmol/L,细胞出现显著凋亡形态学改变,凋亡率明显增高,Bcl-2的表达水平降低。结论自噬可作为一种保护机制来抵御As2O3对外周血淋巴细胞的损伤,3-MA可能通过下调Bcl-2的表达而增加As2O3对外周血淋巴细胞的损伤效应。

应用活体成像技术对三氧化二砷抗小鼠4T1乳腺癌作用的研究

采用小动物活体光学成像技术研究三氧化二砷(As2O3)的抗小鼠乳腺癌作用,并比较小动物活体成像技术与常规技术的优劣性。以荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记小鼠4T1乳腺癌(4T1-Luc)细胞,MTT比色法和生物发光法(BLM)检测细胞增殖活性,细胞形态学及AnnexinⅤ/PI双标记法观察细胞凋亡;4T1-Luc细胞接种小鼠乳腺脂肪垫制作原位乳腺癌模型,腹腔注射5、10mg/(kg.d)As2O3治疗20d,小动物活体成像系统动态观察肿瘤生长。肿瘤称重,HE和CD34免疫组化染色观测肿瘤细胞分裂、坏死和新生微血管。结果,BLM检测结果与MTT法高度相符,1、2、4、8、16μmol/L As2O3显著抑制4T1-Luc细胞增殖,并呈现典型的凋亡改变;As2O3在体内呈时间和剂量依赖性地抑制模型小鼠4T1-Luc乳腺癌的生长,活体成像法优于肿瘤重量法。肿瘤组织内核分裂细胞和微小血管减少,中心呈坏死改变。结果表明,As2O3体外诱导小鼠乳腺癌4T1细胞凋亡,通过减低肿瘤新生血管形成、促使其坏死在体内发挥抗乳腺癌作用;与传统技术相比,小动物活体成像技术具有非损伤、实时动态监察和高灵敏度的特点。

纳米雄黄抗B16小鼠恶性黑色素瘤和抗新生血管形成作用的研究

为了用活体成像技术对纳米雄黄体内外对小鼠恶性黑色素瘤细胞(B16)增殖的抑制作用和机制进行研究,以萤火虫荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记小鼠B16黑色素瘤(B16-Luc)细胞,用生物发光法(bioluminescent method,BLM)检测细胞增殖活性;以细胞形态学及AnnexinⅤ+PI双标记法观察细胞凋亡情况。采用B16-Luc细胞接种雄性BALB/c小鼠腋窝制作黑色素瘤模型,用纳米雄黄[4mg/(kg·d)和8mg/(kg·d)]灌胃治疗20d,以小动物活体成像系统动态观察肿瘤细胞的生长情况。治疗末期处死动物,取出肿瘤组织,固定、制片、HE染色,光镜下观察组织形态变化。结果显示,体外和体内纳米雄黄呈时间和剂量依赖性地抑制小鼠B16-Luc黑色素瘤的生长(P<0.01);肿瘤组织制片观察时,经纳米雄黄治疗后肿瘤组织内微小血管显著减少(P<0.01),肿瘤组织内部呈显著的坏死改变。结论:经用活体成像技术研究,纳米雄黄体内外能抑制小鼠B16-Luc黑色素瘤细胞的增殖并诱导其凋亡,通过抑制肿瘤组织内新生血管的形成而发挥抗小鼠恶性黑色素移植瘤作用;与传统技术相比,活体成像技术的灵敏度更高,在监测肿瘤细胞的生长方面优势更大。

三氧化二砷诱导K562／ADM细胞内质网应激反应性凋亡的机制研究

内质网应激反应性凋亡途径是不同于经典的线粒体途径和死亡受体途径的细胞凋亡通路。三氧化二砷（As2O3）对白血病以及其他实体肿瘤均具有良好的抗肿瘤效应，且与常规化疗药物无交叉耐药性。我们的前期研究证实As2O3可通过内质网应激反应性凋亡途径诱导白血病多药耐药（MDR）细胞凋亡，并调控多种耐药和凋亡相关基因的表达。本研究中我们以白血病MDR细胞K562／ADM为模型，探讨As2O3诱发耐药白血病细胞内质网应激反应性凋亡的可能机制。

辣椒素诱导白血病和肝癌细胞凋亡的比较研究

目的:比较合成辣椒素(N-Vanillylnonanamide)诱导白血病细胞K562及其多药耐药K562/ADM、肝癌HepG2细胞凋亡的作用。方法:以K562细胞、K562/ADM细胞和HepG2细胞为靶细胞,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性,流式细胞法测定细胞周期和AnnexinⅤ/PI双染色检测细胞凋亡。结果:MTT示合成辣椒素可抑制白血病细胞和HepG2细胞的增殖,根据同时期半数抑制浓度(IC50)示HepG2细胞最敏感,K562细胞较K562/ADM细胞敏感。合成辣椒素可阻滞细胞周期。合成辣椒素诱导24小时后AnnexinⅤ/PI双染色显示白血病细胞和肝癌细胞凋亡率升高;白血病敏感细胞株和耐药细胞株的对合成辣椒素敏感性相似。结论:合成辣椒素可抑制白血病和肝癌细胞的增殖并诱导其凋亡;辣椒素对药物敏感和耐受的白血病细胞的作用相似。

三氧化二砷诱导白血病K562细胞凋亡与线粒体和内质网的作用

目的:研究三氧化二砷(Arsenic trioxide,As2O3)诱导白血病K562细胞凋亡的机制以及线粒体和内质网的作用。方法:采用MTT比色法测定细胞增殖活性,细胞形态学和AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡,电镜观察凋亡细胞内质网和线粒体形态结构变化;流式细胞术(FCM)测定线粒体跨膜电位(Δψm)、细胞内Ca2+浓度、活性氧(ROS)水平、细胞色素c(Cytc)含量及Caspase-3活性;RT-PCR检测GRP78 mRNA表达,Western blot法检测GRP78/Bip蛋白表达。结果:2mol/L和5mol/LAs2O3显著抑制K562细胞的增殖和诱导其凋亡。As2O3诱导K562细胞发生凋亡过程中,线粒体内外膜融合,嵴紊乱,肿胀,内膜扩张呈空泡样变,内质网明显扩张和脱颗粒;线粒体Δψm降低,细胞内Ca2+浓度、Cytc释放和ROS水平明显升高,Caspase-3活性显著增强;GRP78 mRNA和蛋白表达无明显改变。结论:线粒体和内质网均参与As2O3诱导K562细胞的凋亡过程,但不能触发内质网应激反应性凋亡。

小白菊内酯对白血病K562细胞及其干细胞的作用

目的:研究小白菊内酯(parthenolide,PTL)对白血病K562细胞及其白血病干细胞(leukemia stem cells,LSC)的作用。方法:以白血病K562细胞为靶细胞,四氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性,AnnexinⅤ/PI染色法测定细胞凋亡;流式细胞术检测LSC相对含量,甲基纤维素集落形成法检测细胞的自我更新和增殖能力。结果:PTL显著抑制K562细胞的增殖,24,48,72 h的IC50分别为17.1,8.67,9.42μmol.L-1。5,10μmol.L-1PTL处理48 h,K562细胞的凋亡率分别为(49.56±5.11)%,(71.88±2.12)%。结合干细胞免疫标志分析,K562细胞中LSC样(CD34+CD38-)细胞的凋亡率分别为(52.63±4.14)%,(57.50±4.47)%。K562细胞中LSC的相对含量仅轻度增高,但高浓度(15μmol.L-1)PTL处理,LSC含量则增高15倍。0.5～4.0μmol.L-1PTL显著抑制K562细胞的集落形成能力,集落数降低24.1%～89.2%;5～15μmol.L-1PTL预处理,存活K562细胞的集落形成数增高5.0%～50.0%。结论:小白菊内酯可抑制K562细胞及其干细胞的增殖活性,并诱导其凋亡。

白血病K562／ADM细胞耐药性与白血病干细胞及耐药蛋白表达的关系

目的观察白血病药物敏感和耐受细胞中自血病干细胞（LSC）、耐药蛋白表达和耐药性的关系。方法以白血病多药耐药株K562／ADM细胞及其亲本K562细胞为模型，MTT比色法测定细胞的药物耐受性；流式细胞术检测细胞免疫标志、P-糖蛋白（P—gP）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的表达；甲基纤维素集落形成法检测细胞的自我更新和增殖潜能。结果K562／ADM细胞对阿霉素、柔红霉素和鬼臼乙叉苷高度耐受。K562／ADM细胞中CD34^＋、CD123^＋和CD34^＋CD38^-细胞含量均显著高于K562细胞，LSC细胞相对含量是K562细胞的4．12倍；共表达P-gP和BCRP的K562／ADM细胞比K562细胞高11．25倍，其中CD34^＋CD38^-CD123^＋BCRP^＋和CD34^＋CD38^-P—gP^＋BCRP^＋细胞数量分别为K562细胞的3．66倍和11．37倍。K562／ADM细胞集落形成率是K562细胞的4．17倍，与LSC含量相当。结论白血病K562／ADM耐药细胞中存在的高表达耐药蛋白的耐药性LSC是其多药物耐受性的根源。