RNA干扰下调MBP-1对骨肉瘤Saos-2细胞生物学的影响

目的探讨c-myc启动子结合蛋白1(MBP-1)基因沉默对人骨肉瘤Saos-2细胞生长的影响。方法实验分为3组:正常对照组(未转染骨肉瘤细胞)、阴性对照组(转染错义序列组)和沉默组(转染MBP-1 sh RNA组)。设计2条MBP-1基因的RNA干扰片段及1条阴性对照si RNA,并与p SIREN-retro Q质粒连接。将重组p SIREN-retro Q质粒通过Lipofectamine 2000脂质体转染骨肉瘤Saos-2细胞。实时PCR和Western blot分别检测MBP-1表达。CCK-8法对MBP-1沉默后骨肉瘤Saos-2细胞生长进行检测。Western blot检测对照组和沉默组cyclin D1和cyclin E的表达。结果通过PCR扩增及测序,说明已成功构建MBP-1沉默及对照重组p SIREN-retro Q质粒。实时PCR结果显示,沉默组MBP-1 m RNA相对表达量与对照组相比显著下调(P<0.05)。Western blot结果显示,沉默组MBP-1蛋白表达量与对照组相比也显著下调。CCK-8法结果表明,沉默组细胞在48、72和96 h时增殖能力均比对照组显著升高(P<0.05)。沉默组cyclin D1和cyclin E的表达显著高于对照组(P<0.05)。结论 MBP-1基因沉默后骨肉瘤Saos-2细胞生长被明显促进,为寻找骨肉瘤基因治疗新靶点打下基础。

RNA干扰MBP-1基因对胃癌细胞SGC-7901增殖影响

目的探讨MBP-1(c-myc promter binding protein 1,MBP-1)基因表达沉默对胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖影响。方法实验分3组:空白对照组(未转染胃癌细胞)、阴性对照组(转染错义序列)和干扰组(转染MBP-1shRNA)。设计2条针对MBP-1基因的小干扰RNA片段及1条阴性对照siRNA,并构建入pSIREN-retroQ质粒。将构建的重组pSIREN-retroQ质粒通过Lipofectamine 2000脂质体转染胃癌SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳转株细胞。Real time PCR和Western blot分别检测MBP-1表达。MTT法对MBP-1干扰后SGC-7901细胞增殖进行检测。结果通过PCR扩增阳性克隆及测序,说明已成功构建MBP-1干扰及对照重组pSIREN-retroQ质粒。通过Lipofectamine 2000脂质体将重组质粒转染胃癌SGC-7901细胞,并通过嘌呤霉素筛选2周,说明已成功构建MBP-1干扰及对照SGC-7901稳转株细胞。Real time PCR检测,干扰组MBP-1mRNA相对表达量与空白对照组相比显著下调(P<0.05)。Western blot检测MBP-1蛋白表达,干扰组MBP-1表达量与空白对照组相比也都显著下调。MTT法检测结果表明,MBP-1干扰组细胞在48、72、96和120h增殖能力比空白对照组都有显著的升高(P<0.05)。结论下调MBP-1基因表达能明显促进胃癌细胞SGC-7901的增殖,从而为胃癌基因治疗提供了新靶点。

经Flk1前祖细胞胚胎干细胞分化为内皮细胞的研究

目的掌握小鼠胚胎干细胞（ESCs）向内皮细胞分化方法，为临床心血管疾病治疗研究的发展奠定基础。方法分化前检测ESCs自我更新标记分子的表达。单层分化4d检测血管内皮生长因子受体2（Flk1）的表达。分化8d检测血管内皮钙黏蛋白（VE—cadherin）的表达，同时于显微镜和透射电镜下观察分化细胞形态。最后在血管内皮生长因子（VEGF）诱导组分化2、4、6、8、10d检测八聚体结合转录因子4（Oct4）、Flk1和vE—cadherin的表达。结果分化前自我更新标记分子的表达结果说明E14细胞具有自我更新能力。分化4d表达Flk1，说明E14细胞分化为中胚层前祖细胞；分化8dVE—cadherin的表达说明E14细胞分化成为血管内皮细胞。分化8d光镜下观察内皮细胞特征性呈“鹅卵石”样结构非常明显；透射电镜下可观察到韦-帕小体（W—P）小体，以上结果说明E14细胞分化成为内皮细胞。最后，对分化用VEGF诱导组分化2、4、6、8、10d的Oct4、Flkl和VE—cadherin表达范围有了掌握。结论单层分化8d，VE—cadherin的表达说明E14细胞已分化为成熟血管内皮细胞。掌握ESCs向血管内皮细胞定向分化方法为临床心血管疾病治疗研究的发展奠守基础。