兰州市母婴间念珠菌传播的流行病学研究

目的:调查兰州市产妇念珠菌的定殖以及母婴间念珠菌的传播状况。方法:采集产妇的阴道分泌物及口腔分泌物样本(共104×2例),及其新生婴儿的口腔分泌物样本(共104例)。采用CHROMagar念珠菌显色培养基进行培养、分离及鉴定,同时应用分子生物学技术对结果进行验证鉴定。结果:312例样本(母亲104×2,新生儿104)中81例分离培养出念珠菌,产妇阴道念珠菌检测阳性率39.42%(41例),产妇口腔念珠菌阳性率33.65%(35例),其中21.15%(22例)阴道与口腔同时阳性;新生儿口腔念珠菌培养阳性率为4.81%(5例)。检出阳性样本中菌种分布为,白色念珠菌53株,光滑念珠菌33株,克柔念珠菌2株,热带念珠菌1株。有2对母婴同时分离出白色念珠菌,经PCR检测,其基因型相同。结论:兰州市新生儿念珠菌检出率以及母婴间念珠菌的传播率较其他地区高。新生儿念珠菌感染与念珠菌的水平传播和垂直传播都相关。监控医院内念珠菌的传播及预防母亲产前阴道念珠菌感染可减少新生儿念珠菌感染的可能性。

X线照射诱导人胃癌SGC-7901细胞生物特性改变以及YKL-40基因表达变化

目的观察X线照射后胃癌SGC-7901细胞形态改变、细胞周期分布情况以及是否可以诱导YKL-40基因的表达。方法将胃癌细胞株SGC-7901分为空白对照组(不照射)和实验组(2Gy/1f和4Gy/2f),实验组细胞经6-MVX线照射后取两组细胞在倒置显微镜下观察细胞形态学的改变,流式细胞术检测SGC-7901细胞周期的变化情况,半定量RT-PCR检测基因YKL-40mRNA的表达。结果实验组(2Gy/1f)细胞经X线照射后出现明显的形态学改变;流式细胞检测发现,与空白对照组细胞比较,2Gy、4Gy实验组细胞S期上调,G2/M期下调,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测胃癌细胞株SGC-7901不表达YKL-40或检测不到YKL-40mRNA,经X线照射后YKL-40表达。结论 X线照射可使人胃癌细胞发生形态改变及细胞增殖周期再分布,并且可诱导人胃癌细胞表达YKL-40。

幽门螺杆菌口腔定植和胃肠疾病的关联性研究

目的分析口腔中幽门螺杆菌(H.pylori)的定植与胃肠疾病的关联性。方法采用细菌培养法,对173名胃肠疾病患者的唾液标本进行H.pylori检测,同时根据年龄、性别、胃肠疾病类型和牙周状况分组,分析不同组别H.pylori检测结果的差异性。结果胃肠疾病患者口腔唾液中H.pylori阳性率为40.46%。其中,男性高于女性(P<0.05);45～64岁年龄组H.pylori阳性率为56.72%,明显高于2个低年龄组(P<0.05);萎缩性胃炎组H.pylori阳性率为77.78%,与消化性溃疡组和浅表性胃炎组相比差异有统计学意义(P<0.05);牙周健康组和牙周袋组的H.pylori阳性率分别为15.38%、72.73%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 H.pylori在口腔中是一种条件致病菌,口腔中H.pylori检出率与牙周疾病的严重程度呈正相关,胃肠疾病患者口腔中H.pylori检出率与胃肠疾病的类型密切相关,不良牙周健康状况可能是胃肠疾病发生及复发的重要因素之一。

白假丝酵母菌对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞增殖的诱导作用

目的研究白假丝酵母菌(S.albicans)对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞增殖及细胞周期的影响。方法体外培养ECV304,实验分为S.albicans上清液组、S.albicans灭活菌液组、上清液和灭活菌液混合组、对照组。采用MTT法、细胞计数法、倒置显微镜及流式细胞术分别观察各组对ECV304细胞增殖及细胞周期的影响。结果在不同浓度、不同时间的培养条件下,4倍稀释的S.albicans上清液在培养48 h能显著促进细胞增殖;倒置显微镜观察发现4倍稀释的S.albicans上清液实验组细胞密度明显增高;上清液和灭活菌液分别作用细胞40h后,上清液组细胞S期、G2/M期所占百分比显著升高,增殖指数(PI)增高,与对照组相比,有显著性差异(P<0.05)。而灭活菌液组的PI值无显著性差异(P>0.05)。结论 S.albicans的代谢产物可引起ECV304细胞的增殖。

FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的构建脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)基因的真核表达载体,并检测其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。方法采用逆转录方法从星型细胞瘤组织中扩增FABP7基因,双酶切后插入线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,构建重组真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7后,采用半定量RT-PCR检测FABP7基因mRNA的表达,MTT法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的周期变化情况,并对细胞进行计数。结果FABP7基因重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染MCF-7细胞后48、72和96h,pcDNA3.1-FABP7组的细胞数和细胞的A490值均比pcDNA3.1空质粒组明显降低,G1期细胞百分含量均明显升高。结论已成功构建了FABP7基因的真核表达载体,该载体可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖。

WHHL家兔在心血管疾病研究的应用

遗传性高血脂(WHHL)家兔为单基因隐性突变,造成细胞膜低密度脂蛋白受体缺乏,引起肝脏对低密度脂蛋白的清除延迟,血浆胆固醇水平升高,能够自发形成高胆固醇血症。在此基础上,经过选择性培育,选择出易发生冠状动脉粥样硬化的WHHL家兔,其血浆低密度脂蛋白水平更高,并形成了与人类相似的典型的冠状动脉粥样斑块;WHHL家兔形成易损斑块发生致命性的心肌梗死〔1〕,此家兔为WHHLMI家兔。

EDA-A1基因突变体对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖及细胞周期的影响

目的研究少汗型外胚层发育不良症EDA-A1基因突变体对人脐静脉内皮细胞(ECV)周期和增殖活性的影响。方法构建EDA-A1基因编码序列(CDS)突变体和野生型的真核表达载体pcDNA3.1(-)-EDA-A1-M/W,转染人脐静脉内皮细胞,逆转录PCR(RT-PCR)扩增EDA-A1基因,蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测EDA-A1蛋白表达,MTT法、流式细胞术检测EDA-A1基因突变体对ECV细胞增殖和细胞周期的影响。结果 RT-PCR、Western blot结果显示,野生型组和突变体组ECV细胞表达EDA-A1基因及其蛋白,而空质粒转染组[pcDNA3.1(-)]和空白对照组细胞无表达。与对照组(空质粒租)相比,突变体组ECV细胞增殖活性下降,生长抑制率为45.70%(P<0.01),野生型细胞增殖活性无明显改变(P>0.05)。突变体组中有更多细胞进入G0/G1期、S期;野生型组S期细胞增多,G2/M期细胞明显减少(P<0.05)。结论突变体和野生型EDA-A1基因对ECV细胞增殖和细胞周期有不同的生物学功能。

YKL-40基因真核表达载体的构建及对人胃癌SGC-7901细胞增殖作用的影响

目的:构建针对人类软骨糖蛋白-39(HCGP-39,YKL-40)的真核表达载体,观察其对肿瘤细胞增殖的影响.方法:采用逆转录方法从乳腺癌组织中获得基因YKL-40,双酶切后插入线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,重组体经限制性内切酶及测序鉴定,将阳性克隆的载体转染胃癌细胞株SGC-7901,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性、细胞计数并观察细胞生长情况、半定量RT-PCR检测基因YKL-40 mRNA的表达、流式细胞术检测SGC-7901细胞的周期变化情况.结果:限制性内切酶及测序鉴定表明成功地构建了针对基因YKL-40的真核表达载体;将其转染胃癌细胞SGC-7901后,发现细胞增殖加快,差异具有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测基因YKL-40 mRNA的表达增加;流式细胞检测S期细胞增多.结论:成功地构建了针对基因YKL-40的真核表达载体,该载体可使胃癌细胞株SGC-7901增殖加快.

少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因突变分析及其真核表达载体的构建

目的克隆少汗型外胚层发育不良症(HED)eda-A1基因并进行突变分析,同时构建eda-A1基因编码序列突变型(M)和野生型(W)的真核表达载体pcDNA3.1(-)-eda-A1-M/W,为进一步明析eda基因的功能奠定基础。方法设计含有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点的引物,从HED患者和正常人外周血淋巴细胞中提取总mRNA,利用RT-PCR法克隆eda-A1(M/W)基因cDNA序列;并运用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pcDNA3.1(-)载体和eda-A1基因片段,将eda-A1(M/W)插入到pcDNA3.1(-)载体中,从而构建新的真核表达载体,命名为pcDNA3.1(-)-eda-A1-M和pcDNA3.1(-)-eda-A1-W。结果成功克隆少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因,并发现未见报道过的907位A→C错义突变,导致306位编码氨基酸由谷氨酰胺变异为脯氨酸;经PCR法、重组载体双酶切法、DNA测序验证,成功构建了pcDNA3.1(-)-eda-A1-W/M的真核表达载体。结论成功构建少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因(突变型和野生型)真核表达载体pcDNA3.1(-)-eda-A1-M/W,为进一步研究该基因在牙齿发育中的生物学作用奠定了实验基础。

种传番茄溃疡病菌直接PCR和免疫捕捉PCR检测方法之比较

用PBS和种子研磨后的普通病原提取液稀释番茄溃疡病菌纯菌液,并以梯度纯菌液和带菌种子提取液作为模板进行直接PCR和免疫捕捉PCR,比较2种方法在纯菌液和带菌种子提取液中的检测灵敏度,找到一种高特异性、高灵敏度、简便快捷的方法用于检测番茄种子携带的番茄溃疡病菌。结果显示在纯菌液中直接PCR灵敏度为104cfu/mL,免疫捕捉PCR为102cfu/mL;在带菌种子提取液中直接PCR灵敏度为106cfu/mL,免疫捕捉PCR为104cfu/mL;免疫捕捉PCR比直接PCR灵敏度高100倍,尤其在实际种子检测中优势更明显,而且检出时间短,重复性好。

黄芪浸出液对致龋菌的体外抑菌实验

选择甘肃产黄芪为原料,制成水浸出液,研究其对口腔常见致龋菌的抑制效果,并与国外致龋菌抑菌产品(MI)进行比较。以变形链球菌、乳酸杆菌为实验菌株,用选择性培养基进行液体培养,在培养基中添加不等量的药物,测培养24h后菌液的A值、pH值;用SPSS13.0对数据进行统计分析。黄芪浸出液对变形链球菌、乳酸杆菌的生长、产酸均有抑制效果,抗菌效果与MI相当。

应用PCR技术快速检测口腔念珠菌菌株

目的:本研究将PCR技术应用于口腔念珠菌检测中,寻找出一种能够快速、准确、有效检测口腔念珠菌的方法。方法:收集口腔临床唾液样本100例,科玛嘉显色培养基进行培养,同时应用PCR方法对100例临床样本进行检测鉴定。结果:传统念珠菌培养方法的检出率为35%;应用两对引物,PCR方法的检出率分别为68%和49%。传统的念珠菌检测方法耗时长,特别是培养法,需时48hrs;应用PCR方法对念珠菌进行检测,只需要5hrs,且阳性检出率和准确性较高。结论:PCR方法快速敏感、特异性高,相较于念珠菌传统培养方法,是一种更加简便理想的检测方法。

RPDs基托材料对口腔念珠菌定植的影响

目的:初步研究可摘局部义齿(RPDs)不同基托材料对口腔念珠菌的定植的影响。方法:临床随机选择RPDs修复患者147例。其中树脂基托义齿(A组)58例,钴铬合金铸造基托义齿(B组)63例,纯钛及钛合金铸造基托义齿(C组)26例。吐唾法取样,用CHROMagar培养基鉴定念珠菌菌种。培养基中念珠菌菌落计数为每个样本的念珠菌检出强度。通过统计学方法,比较3组不同基托材料义齿戴用人群念珠菌检出率和检出强度的差异。结果:147例不同基托材料义齿戴用人群中检出的念珠菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌3个菌种。A、B、C组白色念珠菌和非白色念珠菌检出率无显著差异。白色念珠菌的菌落形成单位数,A组显著高于B、C组(P<0.05);B组显著高于C组(P<0.05)。非白色念珠菌间的菌落形成单位数无明显差异。结论:戴不同材料义齿患者口腔除了能检出白色念珠菌,还可检出非白色念珠菌;口腔念珠菌的菌落形成单位数与义齿基托材料密切相关,钛及钛合金基托义齿应为预防义齿性口炎的首选义齿。

以尼龙膜为载体的基因芯片探针及样品合理浓度筛选

背景:目前多数芯片采用玻璃片基,以Cy3和Cy5标记,价格高,主要用于科研,但不能在临床上大规模推广应用。课题组采用尼龙膜为载体制作基因芯片,以期获得一种具有高灵敏度和准确性、快速简便、可同时检测多种疾病且成本低的芯片。目的:对以尼龙膜为载体基因芯片的可行性进行检测,同时对所用探针及目的基因的量进行优化。设计、时间及地点:基因工程探针设计,于2005-10/2006-09在兰大科技园百源基因公司实验室完成。材料:甘肃省肿瘤医院2005-10/2006-04切除的新鲜大肠癌标本,取距肿瘤边缘5～10cm以上的正常组织作为对照,病理证实无癌细胞浸润。尼龙膜带正电荷,购自Amersco公司。方法:从液氮中取出冻存的新鲜组织200mg,采用Trizol法提取组织总RNA,并用Oligo dT纤维素层析法纯化mRNA。使用TaKaRa的M-MLV Rtase cDNA synthesis Kit(code D6130)反转录合成cDNA的第1,2链,产物分为两部分,一部分作为模板进行地高辛标记PCR,所得产物作为目的基因,另一部分作为制备探针的模板。对获得的GAPDH,Actin,Cyclin D1三种基因片段PCR产物进行纯化。以带正电荷的尼龙膜为载体,将不同浓度的三种基因片段作为探针点于其上,所得芯片分别与不同浓度的地高辛标记目的基因进行杂交。结果:目的基因取2.5μL,1.25μL时,加入杂交液后因目的基因的浓度太小,造成各点探针密度相对较高,而无法反映出正确的显色趋势。目的基因取5μL时,探针密度为10～20μL情况下3种探针显色深度较恰当的反映了由强到弱的趋势,ACTIN>CyclinD1>GAPDH。目的基因取10μL时,探针取15μL,20μL的量能较为合理的反映由强到弱的趋势。目的基因取20μL时,此时杂交液中目的基因的浓度对于ACTIN和CyclinD1过高,不能明显反映二者着色深浅变化。结论:以尼龙膜为载体的基因芯片本底清晰,合理目的基因用量为5μL,与其相匹配的优化探针用量为10～20μL。