脊髓背角PKC在慢性炎性疼痛中的作用及其机制

目的探讨蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的抑制剂和激动剂对痛觉超敏的影响及其分子机制。方法小鼠后趾皮下注射完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)建立炎性疼痛模型;鞘内给予PKC抑制剂白屈菜赤碱(chelerythrine,CHE)或激动剂Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)前后,测定小鼠缩足阈值;随后立即分离脊髓背角,免疫印迹法检测NMDA(N-methyl-D-aspartate)型谷氨酸受体的突触表达。结果 PKC抑制剂CHE在缓解炎性痛觉超敏的同时,明显翻转脊髓NMDA受体NR2B亚基的突触表达亢进;而正常小鼠鞘内给予PKC激动剂PMA,可模拟CFA的效应,即:诱发痛觉超敏,并特异性增加NR2B亚基的突触含量。结论 PKC通过调节脊髓NMDA受体NR2B亚基的突触表达,参与炎性疼痛的形成。

SHP2抑制剂NSC-87877对炎性疼痛的抑制作用及其机制

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(src homology-2 domain-containing phosphatase 2)的抑制剂NSC-87877对炎性疼痛的影响及其机制;方法小鼠左后足底皮下注射完全佛氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant;CFA)建立疼痛模型;鞘内给予NSC-87877前后,测定缩足阈值;随后分离左侧L4-L5节段脊髓背角,免疫印迹法检测N-methyl-D-aspartate(NM-DA)型谷氨酸受体的表达;结果 SHP2广泛分布于脊髓背角;且SHP2抑制剂NSC-87877(3μg)能够抑制CFA诱发的痛觉超敏,而对正常动物的痛行为无作用。虽然NSC-87877不影响NMDA受体NR2B和NR2A亚基的总蛋白含量,但却能够特异性降低CFA组动物NR2B的突触表达水平;结论 SHP2抑制剂NSC-87877通过逆转NR2B的突触表达亢进,对炎性疼痛产生明显的抑制作用。

γ-氨基丁酸能去抑制对脊髓细胞外信号调节激酶2的激动作用

目的探讨脊髓γ-氨基丁酸(GABA)能去抑制对细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)活性的影响及其与痛行为改变的关系。方法正常小鼠鞘内注射(ith)比扣扣灵碱(荷包牡丹碱,bicuculline)50 ng.g-1(5μl)模拟GABA能去抑制,左后足底sc给予弗氏完全佐剂制备炎性疼痛模型,小鼠ith给予GABAA受体激动剂地西泮0.5μg.g-1(5μl)或ERK1/2抑制剂PD-98059 0.25μg.g-1(5μl)后,测定ERK1/2活性和小鼠缩足阈值。结果与正常对照组的缩足阈值(1.24±0.07)g相比,正常小鼠ith给予比扣扣灵碱50 ng.g-1的缩足阈值显著降低〔(0.42±0.17)g,P<0.05〕,给予PD-98059 0.25μg.g-1后缩足阈值显著升高〔(1.29±0.37)g,P<0.05〕。与炎性疼痛模型组的缩足阈值(0.28±0.06)g相比,炎症小鼠ith给予地西泮0.5μg.g-1的缩足阈值显著升高〔(0.99±0.12)g,P<0.05〕,且给予PD-98059 0.25μg.g-1后缩足阈值也显著升高〔(0.97±0.17)g,P<0.05〕。Western免疫印迹结果显示,与正常对照组相比,比扣扣灵碱显著提高ERK2的磷酸化水平〔(152±24)%,P<0.05〕。并且弗氏完全佐剂也可提高小鼠脊髓ERK2的磷酸化水平〔(163±42)%,P<0.05〕,ith给予地西泮0.5μg.g-1,则显著降低CFA诱发的小鼠脊髓ERK2的磷酸化水平〔(91±34)%,P<0.05〕,同时地西泮和PD-98059有效缓解炎性疼痛症状。结论 GABA能去抑制对脊髓背角ERK2有激活作用,并与炎性疼痛的形成有关。

腺苷对脊髓背角NMDA受体的抑制性调节作用

目的研究腺苷对脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型谷氨酸受体的调节作用。方法制备SD大鼠离体脊髓片,在脊髓背角Ⅱ板层神经元上膜片钳全细胞记录NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(EPSCs);提取脊髓背角突触后致密质(PSD)结构,蛋白质印迹法检查NMDA受体的含量。结果胞外灌流腺苷(50μmol/L)能够明显降低EPSCs的幅值(P<0.05),加速EPSCs的衰减(P<0.05);能够显著降低Glu N2B受体在兴奋性突触中的含量(P<0.05)。结论腺苷可能通过降低Glu N2B受体在突触的表达水平,抑制NMDA受体的痛觉突触传递。

外周组织损伤对脊髓AMPA受体突触表达的影响及其机制

目的研究外周组织损伤对脊髓背角AMPA受体突触表达的影响及其分子调节机制。方法小鼠足底皮下注射完全弗氏佐剂(CFA),建立炎性疼痛模型;24 h后分离L4～L5脊髓背角,提取"富含突触后致密质(PSD)"的亚细胞结构,免疫印迹法检测AMPA受体GluR2亚基突触表达的变化,并观察cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)在调节GluR2突触含量中的作用。结果 CFA在引发痛觉超敏的同时,脊髓背角GluR2的突触含量明显升高。虽然PKA抑制剂H-89并不影响正常小鼠的痛阈及GluR2的突触含量,但H-89却能有效缓解炎性痛觉超敏,同时完全翻转CFA诱发的GluR2亚基在突触中的过量表达。结论外周组织损伤通过激活脊髓PKA,明显提高AMPA受体GluR2亚基在脊髓突触中的含量,可能是慢性炎性疼痛形成的重要机制。

非特异性抑制脊髓蛋白酪氨酸磷酸酶的活性对炎性疼痛的影响及其机制

目的研究脊髓蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTPs)在炎性疼痛中的作用及其机制。方法昆明种♂小鼠,左后足底皮下注射完全弗氏佐剂(CFA),建立炎性疼痛动物模型;24 h后,鞘内给予PTPs抑制剂正钒酸钠(sodium orthovanadate,Na3VO4),观察对缩足阈值的影响;免疫印迹法检测正钒酸钠对损伤侧脊髓背角NMDA受体NR2B亚基第1472位酪氨酸(NR2B-Y1472)磷酸化水平的影响。结果鞘内注射正钒酸钠50、100和200 ng,虽然不影响正常动物的痛阈,但却能够剂量依赖性地缓解CFA诱发的机械性痛觉超敏,给药后30 min,炎性疼痛小鼠的缩足阈值从(0.24±0.07)g分别升高至(0.17±0.06)g(P>0.05,n=4)、(1.07±0.51)g(P<0.05,n=4)和(1.38±0.47)g(P<0.05,n=4);同时,CFA诱发的脊髓NR2B-Y1472的磷酸化也被正钒酸钠100 ng所完全阻断。结论 PTPs抑制剂正钒酸钠,通过降低脊髓NR2B的酪氨酸磷酸化,逆转炎性疼痛动物的NMDA受体功能亢进,产生明显的镇痛作用。

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在Ⅰ型代谢型谷氨酸受体诱发痛觉超敏中的作用

目的探讨Ⅰ型代谢型谷氨酸受体(mGluRs)的痛觉调制作用与蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2(Src homology-2 domain-containing phosphatase-2)的关系。方法以免疫共沉淀法,研究小鼠脊髓背角SHP-2与Ⅰ型mGluRs之间的相互作用;通过测定缩足阈值,观察SHP-2抑制剂NSC-87877或SHP-2的无活性突变体SHP-2(C459S)对Ⅰ型mGluRs激动剂DHPG(50 nmol)诱发的痛觉超敏的影响。结果抗m GluR5的特异性抗体,能够从脊髓背角中免疫共沉淀SHP-2,而抗mGluR1的特异性抗体则无法沉淀出SHP-2;以NSC-87877(6 nmol)或SHP-2(C459S)抑制SHP-2的活性,可有效缓解DHPG诱发的痛觉超敏。结论 SHP-2与mGluR5存在分子间的相互结合,SHP-2的激活可能参与Ⅰ型mGluRs的痛觉调制过程。

绿原酸通过抑制AMPA受体的突触表达缓解慢性炎性疼痛

目的研究绿原酸(chorogenic acid,CGA)对完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)所诱发的慢性疼痛症状的影响,并通过检测CGA对炎性小鼠脊髓背角AMPA受体突触表达的影响,探讨其作用机制。方法小鼠后足底皮下注射CFA,以诱导机械性痛觉超敏和热痛觉过敏;鞘内给予CGA,实时测定机械性缩足阈值(PWT)及热刺激潜伏期(PWL)的变化;分离脊髓背角,应用免疫印迹法检测AMPA受体亚基GluA1、GluA2的突触表达和磷酸化水平。结果鞘内注射CGA可剂量依赖性地提高疼痛小鼠的PWT和PWL;高剂量(200 ng)CGA对正常小鼠基础痛阈、运动机能并未产生明显影响;中剂量(100 ng)CGA可有效逆转CFA所诱发的GluA1亚基的突触表达亢进,并明显降低炎性小鼠GluA1-Ser845的磷酸化水平,但未影响GluA1-Ser831的磷酸化。结论CGA可通过特异性逆转脊髓背角GluA1-Ser845的过磷酸化、降低GluA1的突触表达而产生镇痛效应。

如意珍宝片对骨关节炎性痛的抑制作用

目的探讨如意珍宝片对骨关节炎性痛的作用及其机制。方法通过内侧半月板-胫骨韧带切断(destabilization of the medial meniscus,DMM),制作小鼠骨关节炎模型;灌胃给予不同剂量的如意珍宝片(12.5、25、50 mg·kg^(-1)),测定动态痛觉超敏和静态痛觉超敏;制备离体脊髓切片,膜片钳电生理学记录微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSCs)和微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic currents,mIPSCs);免疫组织化学法观察脊髓背角NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptors)GluN1亚基第897位丝氨酸的磷酸化(pS897-GluN1)。结果如意珍宝片能够剂量依赖性地抑制DMM诱发的静态痛觉超敏及动态痛觉超敏,降低mEPSCs的频率,抑制pS897-GluN1的磷酸化,但对mIPSCs无明显影响。结论如意珍宝片能够降低突触前膜对兴奋性递质谷氨酸的释放,抑制脊髓背角NMDA受体的磷酸化,有效缓解骨关节炎性痛。

他克莫司通过上调脊髓背角AMPA受体的突触表达诱发疼痛

目的研究长期使用他克莫司(tacrolimus,or FK506)对小鼠痛行为的影响,并通过检测FK506对小鼠脊髓背角α-氨-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hyroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA)突触表达和受体磷酸化的影响,探讨其诱发疼痛的机制。方法①将24只小鼠随机平均分为两组,FK506组每天腹腔注射FK506构建疼痛模型,Saline组给予生理盐水,每天均注射1次,连续注射7 d。一部分小鼠(每组6只)连续9 d监测小鼠机械性缩足阈值(paw withdrawal threshold,PWT)、热痛觉潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)以及自发性痛行为学的变化,检测模型是否构造成功。另一部分小鼠(每组6只)在注射第7天诱导出明显的疼痛症状后,急性分离脊髓背角,利用免疫印迹法检测AMPA受体亚基GluA1、GluA2的突触表达和磷酸化水平。②FK506+CaN组和FK506+Saline组小鼠,每组6只,在疼痛模型鼠造模完成后给予一次鞘内注射重组钙调蛋白依赖性磷酸酶(calcineurin,CaN)(33 U)或生理盐水,60 min后测定各小鼠的PWT和PWL值,以检测CaN在FK506诱发疼痛中的作用。③另选小鼠18只,将小鼠随机平均分为3组:Control组(腹腔注射Saline后,鞘内注射Saline)、FK506+Saline组(腹腔注射FK506后,鞘内注射Saline)、FK506+CaN组(腹腔注射FK506后,鞘内注射CaN),60 min后,分离脊髓进行免疫印迹实验,检测CaN在FK506调节AMPA受体中的作用。结果①在腹腔连续注射FK506后,小鼠的PWT、PWL值均显著下降,在第7天分别降至对照组的22.3%±0.05%、66.6%±0.05%(P<0.01),并出现明显的自发性痛行为,表现为舔足时间显著增加(P<0.01),疼痛模型制造成功。免疫印迹显示,FK506组脊髓背角GluA1、GluA2亚基的总蛋白表达水平与Saline组差异无统计学意义,但可特异性诱导突触中GluA1的数量增加,GluA1的第845位和第831位丝氨酸的磷酸化水平均显著升高(P<0.05)。②与FK506+Saline组相比,FK506+CaN组小鼠的PWT值和PWL值均升高(P<0.05)。③与FK506+Saline组相比,FK506+CaN组小鼠的脊髓背角突触中GluA1的表达量减少(P<0.01),并且GluA1的第845位和第831位丝氨酸的磷酸化水平也降低(P<0.001)。结论FK506可通过抑制CaN的活性诱导脊髓背角GluA1的突触表达亢进和过磷酸化,最终诱发疼痛。