伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性研究

目的评价伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液的稳定性,为该疫苗原液的制备、储存提供有力的数据支持。方法选取3批伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液分别放置于(37±2)℃、(25±2)℃和2~8℃温度下,根据稳定性研究方案定期取样,对其主要评价指标(多糖含量、结合物含量、相对分子质量、鉴别试验)进行检测,评估疫苗原液的稳定性。结果伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液于2~8℃放置22个月,(25±2)℃放置52 w,(37±2)℃放置24 w时,各项主要评价指标均符合其质量标准的要求。结论伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性良好,在2~8℃可稳定存放22个月。

a型流感嗜血杆菌及其疫苗的研究进展

随着b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)结合疫苗在全球的广泛应用,Hib相关疾病的发病率明显下降;a型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type a,Hia)逐渐成为侵袭性流感嗜血杆菌疾病的重要病原体,且因其发病率高、临床症状重、死亡率高而日益受到关注。本文从Hia的流行概况、相关疾病、药物敏感性、易感人群及其疫苗研究作一综述。

细菌性多糖蛋白结合疫苗免疫应答机制的研究进展

细菌性多糖蛋白结合疫苗是一类重要的、安全有效的预防疫苗。目前该疫苗在控制由流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌等引起的感染性疾病中已取得了巨大的成功,尤其是针对两岁以下的婴幼儿。然而,由于缺乏对其免疫激活机制的了解,多糖蛋白结合疫苗仍存在一些问题,如在高危人群中免疫原性较低。因此,了解细菌性多糖蛋白结合疫苗在机体内的免疫应答机制至关重要,以便设计更为合理的疫苗。传统的免疫机制认为,T淋巴细胞活化是由提呈的多肽诱导,即多糖蛋白结合物中载体蛋白部分的加工产物。近年来,已发现T细胞识别多糖的新机制,显示多糖蛋白结合疫苗的多糖部分积极参与T细胞活化。现就近年来细菌性多糖蛋白结合疫苗免疫应答机制的相关研究作一概述。

13价肺炎球菌结合疫苗在老年人群中的免疫原性研究

老年人群对肺炎球菌疫苗的免疫应答不同于婴幼儿,在对老年人群肺炎球菌疫苗免疫原性的研究中,临床试验设计和判定标准均有所不同。现将美国13价肺炎球菌结合疫苗(13-valent conjugated vaccine,PCV13)在老年人群免疫原性研究的临床资料进行归纳和分析,为国内肺炎球菌疫苗在老年人群中的临床研究提供参考。

经验放大法对肺炎链球菌规模化发酵工艺条件的研究

目的应用经验放大法探索肺炎链球菌规模化基本发酵工艺条件。方法复苏肺炎链球菌菌种,传代培养,最后接种于30 L发酵罐中,以细菌发酵的培养时间、收获液菌浓度A600 nm值、荚膜多糖产率为指标评价发酵工艺;以纯化多糖的功能基团含量、相对分子质量大小(色谱分配系数KD值)、生物活性为指标评价多糖质量。以4型、19F型肺炎链球菌为首选菌株,用于筛选高产菌株、优化传代方法、培养基及30 L发酵罐的通气条件,并应用经验放大法至270 L及1 200 L发酵罐,并将发酵条件推演到其他血清型肺炎链球菌。结果筛选出肺炎链球菌4型和19F高产菌株,利用市售复合培养基,经3代种子液体-液体传代法,0.03 VVM通气条件下,4型和19F菌株在3 0 L发酵罐中获得良好的培养结果;并采用经验放大法至1 200 L发酵罐,获得良好结果。采用此发酵工艺条件,其他20个血清型肺炎链球菌在1 200 L发酵罐中也获得较理想结果。结论应用经验放大法初步探索了肺炎链球菌在1 200 L发酵罐中的发酵工艺条件。

百日咳呼吸道感染模型的研究进展

百日咳呼吸道感染模型是研究百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)致病机制及百日咳疫苗评价的重要手段。人是百日咳鲍特菌的唯一自然宿主,由于受伦理学限制及志愿者重症感染等风险,使人百日咳呼吸道感染模型研究受限。近年来,百日咳呼吸道感染动物模型取得了明显进展。目前,应用于百日咳研究的动物模型主要包括小鼠、小型猪和狒狒等。现就百日咳呼吸道感染模型在百日咳疫苗临床前研究及有效性评价的进展作一概述。

6A型肺炎链球菌荚膜多糖水解物的制备及其结合物在小鼠体内免疫原性研究

目的制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性。方法在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间。通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR)比较验证水解物结构的正确性。以1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(1-Cyano-4-(dimethylamino)pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化水解物的羟基,并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)结合,制备结合物PS6A-TTAH;并检测结合物的理化性质。通过抑制ELISA分析原糖、水解物和结合物的抗原性。将小鼠分为2组(PS6A组和PS6A-TTAH组),分别免疫3剂次,用间接ELISA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性。结果多糖经0.2 mol/L醋酸60℃水解8 h后,其相对分子质量大小(KD)由0.03升高为0.51,重均相对分子质量(Mw)由8.127×10~5g/mol降为1.175×10~5g/mol。核磁共振结果表明,各特征质子的化学位移相比原糖未发生改变。结合物的游离多糖质量分数为4.55%,游离载体蛋白质质量分数为1.08%。抑制ELISA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合。PS6A-TTAH组有剂次加强效应(P分别为0.001、0.004和0.001),其第1~3针免后IgG抗体水平均高于PS6A组,差异均具有统计学意义(P分别为0.001、0.002和0.001)。结论制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团,以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。

百日咳鲍特菌脂寡糖的制备及寡糖结合物在小鼠体内免疫原性研究

目的提取纯化百日咳鲍特菌(简称百日咳杆菌)脂寡糖(lipo-oligosaccharides,LOS),制备百日咳杆菌多糖蛋白结合物,并分析其理化性质及免疫原性。方法通过改良热酚水法提取百日咳杆菌的LOS,采用酶解法纯化LOS,通过1%冰醋酸水解获得寡糖(oligosaccharides,OS),产物经Tricine-SDS-PAGE及核磁共振氢谱(~1H NMR)鉴定。OS的羟基经1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化后,与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TT_(AH))共价结合,制备多糖蛋白结合物,经Sephacryl S-300层析柱纯化后收集结合物原液,并对结合物的理化性质、抗原性进行分析,采用两种剂量(2.5μg/剂和5.0μg/剂)免疫BALB/c小鼠,分析其免疫原性。结果纯化后LOS纯度>90%,核磁共振结果表明OS结构正确,功能基团得到保留。制备的结合物抗原性未发生改变,经3针免疫后,两种剂量下结合物均有剂次加强效应(P<0.05),且两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论将百日咳杆菌OS与TT_(AH)结合是制备百日咳杆菌多糖蛋白结合疫苗的可行途径,并且结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。

9V型肺炎球菌疫苗中多糖含量微孔板蒽酮-硫酸检测方法的建立及验证

目的建立微孔板蒽酮-硫酸法检测9V型肺炎球菌疫苗中多糖含量的检测方法,并对其进行验证和初步应用。方法通过对蒽酮-硫酸方法的改进,建立检测9V型肺炎球菌疫苗中多糖含量稳定可靠的微孔板蒽酮-硫酸法。分别对蒽酮-硫酸法中硫酸溶液浓度、加热时间进行优化,并对建立的方法进行特异性、线性、精密度及准确度的验证。结果最佳硫酸溶液比例为6∶1（浓硫酸∶水）,最佳加热时间为10 min。在检测9V型肺炎球菌多糖、多糖衍生物及多糖蛋白结合物中多糖含量时,此方法特异性强;在20~120μg/m L范围内,标准曲线线性良好（r2〉0.995）;实验内及实验间均具有良好的精密度（CV值分别为2.92%~3.32%和3.10%~4.06%）;准确度试验中3个质量浓度的回收率均在96.17%~106.63%之间。结论微孔板蒽酮-硫酸法可被用来有效、准确、稳定地检测9V型肺炎球菌多糖、多糖衍生物及多糖蛋白结合物中多糖的含量,该方法较传统蒽酮-硫酸法操作简便快捷,节约样品、试剂等材料,非常适用于相关的疫苗生产过程中的质量控制。

B群脑膜炎球菌H因子结合蛋白研究进展

H因子结合蛋白(factor H-binding protein, fHbp)是脑膜炎奈瑟菌(简称脑膜炎球菌)表面的一种关键毒力调节因子。fHbp通过与其配体H因子结合,使得脑膜炎球菌逃避人体免疫系统的识别和攻击,进而可在人体血液中生存,可引起脑膜炎和败血症等临床表现。由于B群脑膜炎球菌(Meningitidis serogroup B,MenB)荚膜多糖与人体神经组织具有相似性,因而荚膜多糖不适合作为疫苗的抗原成分。MenB疫苗大多采用蛋白疫苗的研发路线,研究人员通过反向疫苗学技术确定了fHbp及其他膜蛋白的免疫效果,其中fHbp是最有潜力的疫苗候选抗原成分,且该蛋白是目前已上市的MenB疫苗(Trumenba~?和Bexsero~?)的共有成分。现就fHbp作为MenB疫苗的抗原成分在疫苗中的研究进展作一概述。

新型肺炎链球菌疫苗研究进展

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是引发人类肺炎、中耳炎、脑膜炎的主要病原体。为了预防肺炎链球菌感染,人类已研制出了多种相关的疫苗。目前,常用23价肺炎球菌多糖疫苗(23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine,PPV23)预防成人和2岁以上儿童肺炎链球菌的感染,用7价、10价、13价肺炎球菌结合疫苗来预防婴幼儿肺炎链球菌的感染。虽然荚膜多糖类疫苗能预防其所包含的肺炎链球菌血清型的感染,但非疫苗血清型的菌株还是可以在鼻咽部定植,并引起感染,而且结合疫苗研制工艺复杂、价格昂贵,在发展中国家使用还不普及。鉴于上述原因许多疫苗公司开始研发具有保护力强、价格低廉的新型疫苗。近年来,肺炎链球菌全细胞疫苗和肺炎链球菌纯化蛋白疫苗由于其血清非依赖性和较低的生产成本已成为人们关注的焦点。现对肺炎链球菌新型疫苗的研制及临床应用作一概述。

部分欠发达国家肠道疫苗使用现状研究

肠道感染是导致部分欠发达国家人群发病率和死亡率较高的主要原因之一。迄今,在公共卫生方面,疫苗控制肠道感染所发挥的作用仍很有限,而且肠道疫苗在部分欠发达国家很少使用的原因也是多方面的,包括财政和环境等方面限制。更为重要的是,需要寻找更有说服力的证据证明肠道疫苗在部分欠发达国家人群中的效果。现通过对轮状病毒疫苗、伤寒疫苗、霍乱疫苗这3种疫苗现阶段在部分欠发达国家的使用情况作一概述,并对肠道疫苗在实际应用中的地区性疫苗效果、年龄组使用和群体免疫效果等现状进行分析。

肺炎链球菌荚膜多糖纯化及质量控制方法的研究现状

肺炎链球菌(简称肺炎球菌)荚膜多糖(capsular polysaccharide, CPS)位于肺炎球菌的最外层,是肺炎球菌主要的毒力因子之一,也是有效的保护性抗原。获得高质量的肺炎球菌CPS,是肺炎球菌多糖疫苗(pneumococcal polysaccharide vaccine, PPV)和肺炎球菌结合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine, PCV)的重要基础。因此,有效、合理的纯化方法和可靠的质量控制对肺炎疫苗生产至关重要。现就国内外肺炎球菌CPS纯化方法和质量控制研究现状作一概述。

白喉毒素突变体CRM197的研究及应用

白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由感染β噬菌体基因组的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)所产生的外毒素,具有极强的细胞毒性。而交叉反应物质197(cross-reacting material 197,CRM197)是DT无毒突变体。CRM197通过氨基酸突变导致其丧失细胞毒性,目前在感染性疾病的预防用疫苗开发、非感染性疾病的治疗用疫苗开发、癌症治疗等领域得到了广泛尝试和运用。现就CRM197的分子基础、异源表达以及应用现状作一概述。

超滤法透析Y群脑膜炎球菌荚膜多糖的研究

目的对超滤法透析Y群脑膜炎奈瑟菌(简称脑膜炎球菌)荚膜多糖的方法进行优化。方法分别用恒压恒体积和恒泵速恒体积法、以0.5 mol/L氯化钙溶液和注射用水为透析液超滤Y群脑膜炎球菌荚膜多糖苯酚抽提上清液,耗用透析液体积5倍于料液体积时停止超滤,超滤结束后,向氯化钙超滤样品中直接加入乙醇沉淀多糖,向注射用水超滤样品中加入氯化钙溶液后再加入乙醇沉淀多糖。比较各种超滤方法透析过程中的膜包水通量、透析耗用时间和超滤器进口压力的变化。比较各种超滤方法所获多糖的收获量、唾液酸和O-乙酰基含量以及蛋白质、核酸、内毒素和苯酚残留量。结果在恒压恒体积模式超滤中,用0.5 mol/L氯化钙溶液超滤膜包水通量逐步降低,7 min后维持在421 mL/(m^(2)·min);用注射用水超滤时,膜包水通量逐步升高,7 min后维持在725 mL/(m^(2)·min);完成5倍体积透析液透析后,0.5 mol/L氯化钙透析耗时20 min,注射用水透析耗时13 min。在恒泵速恒体积模式超滤中,用0.5 mol/L氯化钙超滤时,超滤器进口压力逐步升高,11 min后维持在0.59 bar(注:1 bar=105 Pa);用注射用水超滤时,超滤器进口压力逐渐降低,9 min后维持在0.22 bar;各种超滤方法对精制多糖的收量、生化指标、内毒素和苯酚残留量均无影响。结论先用注射用水恒压恒体积模式超滤,然后再加入氯化钙的方法能有效缩短超滤时间,减少氯化钙用量,且不影响各种生化指标。

无动物源成分伤寒沙门菌Ty2株种子批传代稳定性研究

目的检定无动物源成分伤寒沙门菌Ty2株主代种子及工作种子,验证工作种子连续传代30代次的传代稳定性,为伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗无动物源工艺的建立提供前期研究数据。方法无动物源成分伤寒主代种子、工作种子及脱脂牛奶工作种子分别连续传代至第30代次,在《中华人民共和国药典》2020版(三部)(简称《中国药典》)伤寒沙门菌检定要求的基础上,进一步应用16S rRNA基因序列分析、多位点序列分型(multilocus sequence type,MLST),并以伤寒主要抗原表位Vi抗原片段中毒力基因viaB区域为参考基因组,比对连续传代伤寒工作种子基因序列的遗传稳定性。结果无动物源成分伤寒主代种子、工作种子及脱脂牛奶工作种子分别连续传代至第30代次种子,表型鉴定结果均符合《中国药典》伤寒沙门菌检定要求;连续传代至第30代次,Vi抗原血清凝集效价、O抗原血清凝集效价均未发生明显变化;16S rRNA基因序列鉴定PCR产物大小在1474~1478 bp之间,与NCBI数据库比对鉴定均为肠沙门菌肠亚种伤寒血清型;MLST分型结果表明,疫苗用伤寒沙门菌Ty2株为ST1型,连续传代30代次MLST序列分型保持一致;以伤寒Vi抗原片段中毒力基因viaB区域为参考基因组(GenebankD14156.1),伤寒主代种子及有、无动物源成分工作种子连续传代30代次,它们的viaB区基因序列均一致;它们与Genebank中viaB参考基因序列比对,均有3个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。结论无动物源成分伤寒沙门菌Ty2株,经与脱脂牛奶株连续传代30代次比较,各项菌种检定结果均符合《中国药典》要求,相关基因性状保持一致且稳定,无动物源成分伤寒沙门菌Ty2株遗传稳定性良好,可用于疫苗的研发和生产。

硫酸-咔唑微孔板法检测肺炎链球菌荚膜多糖中糖醛酸含量

目的利用微孔板检测肺炎链球菌荚膜多糖中糖醛酸含量,并对该方法进行验证及初步应用。方法以微孔板为反应容器,对常规硫酸-咔唑法的咔唑质量浓度和加热时间进行优化;并对建立的方法进行线性范围、精密度以及准确度的验证及初步应用。结果最佳的咔唑质量浓度为0.10 mg/m L,加热时间为20 min。标准品D-葡萄糖醛酸在4~40μg/m L范围内,其质量浓度与校正后吸光值呈良好的线性关系,r2>0.99;批内及批间CV值分别为1.54%~3.02%及4.53%~7.75%;加入5μg/m L、10μg/m L、20μg/m LD-葡萄糖醛酸的8-160502、9V-160102、22F-160103荚膜多糖,D-葡萄糖醛酸的回收率为92.21%~110.47%。微孔板法校正前与常规方法在测定肺炎链球菌荚膜多糖中糖醛酸含量时差异无统计学意义(P>0.05),与校正后结果差异有统计学意义(P<0.05)。微孔板法测定分子质量分布与常规方法有较好的一致性。结论硫酸-咔唑微孔板法可有效检测肺炎球菌荚膜多糖中糖醛酸含量,操作简便快捷,精密度和准确度良好,可用于肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的质量控制。

间苯二酚显色法测定唾液酸含量的影响因素

目的探讨间苯二酚显色法测定唾液酸含量的影响因素,保证试验结果的一致性和准确性。方法按照《中国药典》2015版(三部)规定的唾液酸含量测定方法,分析单糖和二糖、载体蛋白质、不同溶液及化学试剂对该方法测定结果的影响;比较加热时间、加入有机相后的放置时间对检测结果的影响。结果选用的不同单糖和二糖中,蔗糖对试验的影响最大,低中高浓度时吸光值分别为0.065、0.196、0.420;其次是核糖,3种浓度的吸光值分别为0.037、0.113、0.187;高浓度的半乳糖、葡萄糖和乳糖的吸光值在0.02左右,对试验结果有一定影响,低浓度时对试验的影响可以忽略不计。N-乙酰甘露糖胺在低中高浓度时对结果均无影响。破伤风类毒素、重组绿脓杆菌外毒素A、小牛血清白蛋白、白喉类毒素对检测结果无影响,在500μg/m L质量浓度时吸光值均在0.008以下。选用的不同溶液对试验均无影响。选用的化学试剂中乙醇、低浓度的碳二亚胺以及己二酰肼对试验结果均无干扰,丙酮和脱氧胆酸钠均会对试验造成较大影响。反应液的吸光值随着加热时间的延长而增加,吸光值随着放置时间的延长而降低;第一小时内吸光值下降9%左右。结论在质控过程中,这些外源物质及操作过程对唾液酸含量测定结果有一定影响,应严格按照质量控制标准执行操作。

PCR结合酶切-序列比对法鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株

目的用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定。方法用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移酶sia D基因并对PCR产物进行酶切后,用BLAST软件将PCR产物测序结果与Gene Bank中原始sia D序列比对。结果 15株菌株玻片凝集结果均为阳性;15株菌株的PCR产物片段大小均为460 bp;TaqⅠ酶切后,13株菌株的酶切产物片段大小仍为460 bp,其PCR产物测序比对结果与B群脑膜炎奈瑟菌原始sia D序列同源性均达到99%;其余2株酶切产物片段大小约200 bp,与C群脑膜炎奈瑟菌sia D原始基因序列同源性分别为98%和99%。结论 15株菌株经PCR结合酶切-序列比对法鉴定,13株为B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株为C群脑膜炎奈瑟菌菌株;该方法可准确鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株。

离子色谱法测定ACYW135群脑膜炎球菌结合物中Y群及W135群多糖含量

目的：利用离子色谱法即高效阴离子交换柱层析—脉冲安培检测法（ HPAEC-PAD）,测定ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖含量的方法,并加以验证。方法将ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖用三氟乙酸（ TFA）水解为特异性单糖（葡萄糖、半乳糖）,并去除水解液中残留的TFA,用HPAEC-PAD分析检测,用PA10糖分析柱分离单糖,电化学检测器测定葡萄糖及半乳糖含量,用Chrome-leon色谱工作站记录并分析数据。对上述方法进行专属性、准确性、重复性验证,确定该方法的检出限和定量限。结果 Y群和W135群多糖在TFA2.5 mol/L（终浓度）、90℃、4 h可完全水解为葡萄糖、半乳糖。对照品葡萄糖及半乳糖在0.10-60.00μg/mL 范围内,质量浓度和色谱峰面积呈较好的线性关系, r 均大于0.99,回收率为87.94%-109.80%,相对标准偏差（RSD）为1.00%-2.00%,检出限为0.05μg/mL（信噪比3∶1）,定量限为0.10μg /mL（信噪比10∶1）。结论离子色谱法可同时检测脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群糖含量,该方法操作简便、灵敏、快速,干扰小,重现性好,适用于对相关疫苗生产过程中的质量控制。