预防性及治疗性乙型肝炎疫苗的研究进展

乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B,简称乙肝)是一个严重的世界性公共卫生问题,该疾病在健康人群中发病率极高,同时也在慢性乙肝患者中引起极高的死亡率。乙肝是一种可预防的疾病,用于预防的乙肝疫苗经过三代发展,已有安全、有效的疫苗上市,该疫苗的使用使慢性乙肝患者(包括肝细胞性肝癌患者)的发病率急剧下降。但目前尚无清除乙肝患者体内病毒的特效药物,增强机体免疫反应的治疗性疫苗可能是抗病毒药物的替代品。针对乙肝患者的治疗性疫苗正被广泛研究,包含重组蛋白疫苗、DNA疫苗和脂肽疫苗等。现就国内外预防性及治疗性乙肝疫苗的研究进展作一概述。

通用流感疫苗研究进展

流行性感冒病毒(influenza virus,简称流感病毒)是一种严重威胁人类健康的病毒。全世界每年有上万人死于流感病毒引起的流行性感冒(influenza,简称流感)。同时,流感也对全球经济发展产生严重影响。接种流感疫苗(influenza vaccines)是流感防控的重要手段之一。流感病毒亚型众多、抗原变异较快且因其流行趋势难以预测等因素导致传统流感疫苗接种后免疫效果不佳,研发通用流感疫苗成为预防流感的一种理想策略。现对以流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶(neuraminidase, NA)及流感病毒其他结构蛋白保守区域为免疫原的通用流感疫苗的研究进展作一概述。

狂犬病毒单克隆抗体CHO细胞灌流培养中细胞特异性灌流速率的研究

目的 研究灌流培养中,不同的细胞特异性灌流速率(cell specific perfusion rate, CSPR)对狂犬病毒单克隆抗体CHO细胞生长及抗体蛋白表达的影响,摸索适合本细胞株灌流培养的CSPR。方法 在标号为CSPR 1~5[CSPR1;0.02 nL/(细胞·d)、CSPR2:0.03 nL/(细胞·d)、CSPR3:0.04 nL/(细胞·d)、CSPR4:0.05 nL/(细胞·d)、CSPR5:0.06 nL/(细胞·d),每组3个重复]的15个TPP管中按100万个/mL的初始密度接种相同的CHO种子细胞;摇床中,以转速225 r/min、CO_(2)浓度5.0%、湿度80%和温度37℃的条件培养细胞;以后每天取细胞样品,分别检测活细胞密度(viable cell density, VCD)、细胞活率、葡萄糖浓度、乳酸浓度和渗透压。接种3 d起,每天分别从CSPR 1~5的各管中,按0.02~0.06 nL/(细胞·d)的CSPR计算所需要更换的细胞悬液体积,将各管中的细胞悬液离心,取出相应体积的上清并补入相同体积的新鲜培养液重悬细胞后,继续培养。如细胞悬液中的葡萄糖质量浓度≤3 g/L时,用300 g/L的葡萄糖补至8 g/L。CHO细胞培养约19 d时,结束实验。根据CHO细胞生长、细胞代谢、抗体蛋白滴度(titer)、收获液总体积和抗体蛋白总收量,确定适合本细胞生长和表达的CSPR。结果 在CSPR 1~2[0.02~0.03 nL/(细胞·d)]的条件下灌流培养时,最高VCD分别为1 059万个/mL、1 298万个/mL,细胞活率在培养中后期下降较快,抗体蛋白总收量分别为98 mg和112 mg。CSPR3~5[0.04~0.06 nL/(细胞·d)]条件下的最高VCD分别为1 422万个/mL、1 523万个/mL和1538万个/mL,细胞活率维持较好,抗体蛋白总收量分别为119 mg、120 mg和107 mg。结论 当CSPR为0.04~0.05 nL/(细胞·d)时,细胞生长和抗体蛋白表达情况较好,为适合本细胞株灌流培养的CSPR。

艰难梭菌感染的预防及治疗研究进展

艰难梭菌是抗生素相关性腹泻和假膜性肠炎的主要病原菌,是院内和社区感染的重要因素。艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)给全球医疗保健系统造成巨大的经济负担。传统的抗生素疗法可以有效抑制艰难梭菌,但同时也破坏肠道正常菌群,增加了CDI复发的风险。因此,探索新兴的CDI的预防与治疗策略显得尤为关键。当前,疫苗、单克隆抗体药物及粪菌移植等技术的发展给艰难梭菌的治疗提供了新的途径。现重点就CDI的新兴预防与治疗方法作一概述。

延长单克隆抗体半衰期的研究进展

对于治疗性单克隆抗体而言,半衰期(half-life)是一个关键的药代动力学(pharmacokinetics, PK)参数。延长治疗性单克隆抗体在体内的存留时间,就意味着更低的给药剂量和给药频率,特别是对于需要长期用药的患者来说,这将会极大的减轻他们的经济负担和精神压力。IgG类单克隆抗体在体内的代谢过程与新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor, FcRn)密切相关,它们二者的结合高度依赖于pH的变化,并且在较低pH下二者间的亲和力与IgG的半衰期表现出较强的正相关。通过对IgG-FcRn复合物晶体结构的解析,再结合Fc工程,目前已经发现了诸如M252Y/S254T/T256E(YTE变体)等一些可以显著延长IgG半衰期的Fc变体,并且在临床上得以运用。随着进一步的研究,这些发现将继续指导长效抗体类药物的研发。现就当前在延长单克隆抗体药物半衰期方面的一些研究进展作一概述,旨在为单克隆抗体研究领域内的工作者提供一些新的视角。

重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法的验证

目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60~300μg的抗体含量范围内线性良好,r~2≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%~106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%~20%,半乳糖相对含量≥25%。结论 方法学验证结果显示,所有考察项目中该分析方法均满足要求,可用于重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析。本实验建立的相关质量标准适用于重组人源化抗CD52单克隆抗体生产过程中N-糖糖型的质量控制,也可作为该产品未来商业化生产时放行标准的制定依据。

抗狂犬病毒单克隆抗体中残留宿主细胞蛋白ELISA定量检测方法的验证

目的验证抗狂犬病毒单克隆抗体(单抗)中残留宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法。方法使用商用中国仓鼠卵巢细胞HCP残留ELISA检测试剂盒,测定2种针对不同表位的抗狂犬病毒单抗原液中的残留HCP,并验证该方法的专属性、准确度、精密度、线性、耐用性、检测限及定量限。结果2种抗狂犬病毒单抗发酵液稀释10000倍后检出的HCP含量分别为31.42和19.36 ng/ml。制剂溶液、HEK293F和E.coli培养上清液中未检出HCP。3种浓度的HCP加标供试品的加标回收率均在80%~120%之间。3种浓度的HCP加标供试品重复性检测结果及中间精密度检测结果相对标准偏差均<20%。分别对3次残余HCP检测绘制四参数标准曲线,决定系数均>0.990。在一定范围内改变孵育时间和显色时间,HCP测定结果在合理的偏差范围内。检测限和定量限分别为2和3 ng/ml。结论抗狂犬病毒单抗中HCP残留量的ELISA定量检测方法专属性、准确度、精密度、线性及耐用性良好。

治疗性单克隆抗体表达载体的设计与优化策略

治疗性单克隆抗体的市场需求日益增长,因此如何分离得到高产的稳定表达细胞株及缩短研发过程成为此类研究的热点。在整个治疗性单克隆抗体的研发过程中,哺乳动物细胞表达载体的设计及其优化作为第一步就显得尤为重要。本文从基因转录水平的作用元件、作用方式、基因扩增与筛选标签及位置效应与整合位点的优化对治疗性单克隆抗体表达载体的设计与优化策略作一综述。

人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人源抗狂犬病病毒单链抗体(Single-chain fragment variable,scFv)噬菌体抗体库,并进行筛选。方法以接种过狂犬病疫苗的21份高效价的健康人外周血为原料,提取淋巴细胞总RNA,PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,克隆入噬菌粒pS100,电转化E.coli TG1,建立scFv初级抗体库,并进行基因序列分析及鉴定。以灭活的狂犬病病毒为抗原,进行3轮scFv噬菌体抗体库的富集筛选,随机挑取单克隆,制备噬菌体抗体颗粒,并进行ELISA分析,阳性克隆进行序列分析,采用快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent facus inhibition test,RFFIT)检测噬菌体抗体颗粒的中和活性。结果获得了库容为1.7×108的人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,该抗体库具有较好的序列正确率和多样性,经3轮筛选后,ELISA分析显示,共获得24个序列各不相同的针对狂犬病病毒的阳性克隆,对其中7个克隆的噬菌体抗体颗粒进行RFFIT检测,均具有中和活性。结论已成功构建了人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,并建立了筛选方法。

以CHO细胞为基质的重组单克隆抗体生产中无血清培养基的优化

重组单克隆抗体药物特异性高且疗效显著,是近年来研究的热点药物之一,在肿瘤的诊断与治疗、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等方面具有广阔的应用前景。抗体药物治疗的特点是所需剂量大且治疗周期长,因此市场需求量巨大。基于大规模生物反应器的哺乳动物细胞(特别是CHO细胞)培养技术已逐渐成为生产单抗药物的核心技术。哺乳动物细胞培养技术包括工程细胞株的筛选、无血清培养基的开发与优化、生物反应器培养工艺的优化等环节。本文重点介绍无血清培养基的发展、分类及优化策略,旨在为建立经济高效的单抗体药物生产工艺提供参考。

不同降温温度对抗破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株生长及蛋白表达的影响

目的摸索适合抗破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株生长和抗体蛋白表达的降温温度,为细胞培养工艺的建立提供参考。方法在体积为125 mL的培养瓶中,按50万个/mL的初始密度接种CHO工程细胞种子,采用补料分批培养模式,在转速125 r/min,CO_(2)浓度5.0%,湿度80%的温控培养摇床中进行细胞培养。对照组培养温度设定为37℃恒温;试验组初始培养温度设定为37℃,待培养瓶中的细胞密度达到1000万个/mL时,将培养瓶分别转到35℃、34℃和33℃的摇床继续培养。每日取样,分别检测培养液的活细胞密度、细胞活率、葡萄糖、乳酸、NH^(+)_(4)、渗透压和抗体蛋白滴度。当细胞活率<80%时,停止培养。与对照组比较,选择细胞生长较好,代谢副产物浓度较低且抗体蛋白滴度最高的温度为最终降温温度。结果对照组的最高活细胞密度为2000万个/mL,试验组37℃转到35℃、37℃转到34℃和37℃转到33℃培养条件下的最高活细胞密度分别为2210万、1940万和1890万个/mL;与对照组相比,试验组培养后期的细胞活率维持较高水平;葡萄糖、乳酸和NH^(+)_(4)代谢趋势一致,且试验组代谢副产物乳酸和NH^(+)_(4)浓度低于对照组;各培养组渗透压变化趋势一致,都在可接受范围内;最终抗体蛋白滴度对照组为1196 mg/L,试验组37℃转到35℃、37℃转到34℃和37℃转到33℃的分别为1772、1962和1929 mg/L。结论选取34℃为破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株的降温培养温度,进行后续培养工艺的建立。

全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的筛选及功能验证

目的在噬菌体抗体颗粒水平及全分子抗体水平,对候选抗狂犬病病毒抗体进行筛选与抗体功能验证,以获得理想的备选抗体。方法通过固相包被法从全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库中筛选特异性抗体并对获得的抗体进行中和活性验证,进而挑选中和活性较高的抗体构建真核表达质粒,瞬时转染HEK293E细胞,对全分子抗体进行功能验证。结果对42株已获得的抗狂犬病病毒抗体在噬菌体抗体颗粒水平进行了中和活性验证,其中21株抗体RFFIT值>0.5 IU/mL;筛选出的4株抗体在全分子抗体水平进行中和活性验证,4株抗体RFFIT值>0.5 IU/mL。结论通过在噬菌体抗体颗粒水平及全分子抗体水平对候选抗狂犬病病毒抗体进行筛选与抗体功能验证,获得了4株具有明确中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体。