基于流行性感冒病毒保守区域的通用流行性感冒疫苗的研究进展

流行性感冒(流感)疫情频频暴发,严重危害人类健康和公共卫生。虽然接种流感疫苗能够起到有效的预防作用,但由于流感病毒易变异,使得流感疫苗只对疫苗株或与疫苗株高度相近的病毒株具有保护效果。因此,研制一种可抵御不同型或亚型流感病毒的通用疫苗成为流感疫苗研究的热点。现就基于流感病毒保守区域的通用流感疫苗的研究进展作一综述。

生物反应器内微载体培养细胞的胰酶消化放大技术

目的建立生物反应器内微载体上Vero细胞球转球胰酶消化放大技术。方法用500 ml搅拌瓶培养Vero细胞,待细胞浓度达1.8×106个/ml时,加入25和37℃消化液（0.25%胰酶＋0.02%EDTA）消化不同时间,计算细胞回收率及细胞活率,筛选微载体细胞最佳培养温度及消化时间。将3 L反应器内微载体及T25方瓶培养的Vero细胞消化后接种T25方瓶,比较两种传代方式下的细胞形态及比生长速率。将3 L反应器内微载体培养的Vero细胞用消化液消化后,按1∶3、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的比例接种至15 L反应器,确定最适接种比例。将转瓶及3 L反应器内微载体培养的Vero细胞消化后接种至15 L反应器,比较两种放大方式下的细胞形态、密度及比生长速率。结果微载体上培养的Vero细胞经25℃消化15 min可有效保证细胞的回收率及活率。两种传代方式下的细胞形态及比生长速率无明显区别。细胞比生长速率在1∶6~1∶10比例放大时较高。两种放大方式下的细胞形态、密度及比生长速率无明显区别。结论初步建立了生物反应器微载体内细胞的胰酶消化球转球放大技术,Vero细胞存活率较高,贴壁良好,空珠率较低,可应用于生物反应器微载体培养系统的规模放大。

狂犬病病毒4aG株G蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

目的克隆狂犬病病毒(Rabies virus,RV)4aG株G蛋白基因,并与其他疫苗毒株G蛋白基因序列进行比较,为我国狂犬病疫苗的研制提供理论依据。方法从RV 4aG株中扩增G蛋白基因,并进行序列测定,利用生物信息学软件绘制系统进化树,预测G蛋白功能位点、二级结构和B细胞抗原表位,并与其他疫苗毒株进行比较。结果克隆的4aG株G蛋白基因序列与GenBank中登录的序列一致。进化树分析显示,4aG株与CVS株的进化关系较远;4aG、4aGV18、CVS、PV及RC-HL毒株跨膜区域在第460～479氨基酸之间,其他毒株在459～478氨基酸之间;PV株有5个糖基化位点,RV-97株有3个糖基化位点,其他毒株均有4个糖基化位点;G蛋白抗原表位位于氨基酸100～300及480～520之间;不同毒株G蛋白抗原位点区域有所不同,与CVS株比较,PV株抗原表位与其最为接近,4aG、4aGV18、CTN-1-31及Flury-HEP株与其抗原表位较为接近。结论4aG株G蛋白功能位点和抗原表位与CVS株相差较大,但其在Vero细胞上传代稳定,可用于制备Vero细胞纯化疫苗。

生物反应器微载体规模化培养轮状病毒重配株LH9

目的利用Vero细胞生物反应器微载体培养技术规模化培养轮状病毒重配株LH9(G4型)。方法用3 L生物反应器,以4 g/L载体浓度培养Vero细胞,待细胞浓度达1.8×106个/ml时,分别用含2、1、0.75、0μg/ml胰酶的DMEM培养液,35℃连续培养21 d,观察细胞生长状态。分别按0.5、0.1、0.05、0.01 MOI接种轮状病毒重配株LH9(G4),培养过程中每日取样,检测病毒滴度以及葡萄糖、乳酸含量。根据培养过程中葡萄糖、乳酸含量的变化,确定病毒培养过程中的收获时间,优化培养工艺。结果在反应器中用含不同浓度胰酶的DMEM培养Vero细胞,细胞形态良好,与不含胰酶的DMEM培养液培养的细胞无明显差异;按0.05 MOI接种后的病毒收获液滴度较高,可达7.0 lg CCID50/ml,且持续时间较长;通过对病毒培养液中葡萄糖、乳酸含量的监测,调整了培养过程中的收获时间,收获次数增加至4次,可收获病毒液4个工作体积,病毒高峰滴度可达8.5 lg CCID50/ml。结论采用生物反应器微载体系统培养轮状病毒重配株LH9(G4),可显著提高病毒滴度,通过对培养过程的优化,增加了病毒收获量,为进一步规模化生产轮状病毒疫苗奠定了基础。

生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞工艺的建立

目的建立无血清无蛋白无动物源性培养基BD001悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为MDCK-siat7e细胞的生物反应器规模化培养及病毒性疫苗的研制提供依据。方法采用BD001驯化MDCK-siat7e细胞,建立无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库,对细胞库进行常规检定,观察MDCK-siat7e细胞的生长形态;比较不同起始接种密度(4.0×10~5、8.0×10~5、1.6×10~6 cells/ml)悬浮培养,MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间、平台期细胞密度及活率;比较不同规模生物反应器(3、15、60 L)无血清无蛋白无动物源性培养MDCK-siat7e细胞对数生长期的比生长速率(μ)、分裂次数(Cd)、葡萄糖比消耗速率(q_(gluc))、乳酸对葡萄糖的转化率(Y_(lac)/g_(luc)),观察细胞的生长和代谢情况。结果建立的无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库复苏后细胞平均活率为(96.20±2.95)%。MDCK-siat7e细胞在BD001培养基中复苏传代后生长状态良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第6天进入平台期,第8天达最大细胞密度(6.2×10~6 cells/ml),维持至第12天细胞密度和活率开始下降,进入衰亡期。MDCK-siat7e细胞在无血清培养基中生长良好;不同起始接种密度MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间差异有统计学意义(P<0.05),平台期细胞密度及活率差异无统计学意义(P>0.05);不同规模生物反应器培养的MDCK-siat7e细胞的μ、Cd、q_(gluc)、Y_(lac/gluc)差异均无统计学意义(P>0.05),细胞生长代谢良好。结论建立了生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为病毒性疫苗生产中采用无血清无蛋白、无动物源性培养基,生物反应器规模化培养MDCK-siat7e细胞提供了一定的实验依据。

无血清培养Vero细胞及其传代稳定性分析

目的建立无血清无动物源性培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性。方法采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero细胞的生长曲线;比较140、150、160代Vero细胞在VP-SFM中培养的比生长速率(μ)和分裂次数(Cd);比较142、147、153代Vero细胞在VP-SFM中培养的狂犬病病毒滴度;比较无血清与含血清培养140、150、160代Vero细胞的μ和Cd值;分别在250 ml spinner flask中加入2 g/L cytodexⅠ、在3 L生物反应器中加入3 g/L cytodexⅠ培养Vero细胞,观察细胞贴壁和生长情况。结果建立的无血清无动物源性Vero细胞库,细胞密度为4×10~6个/ml,冻存前细胞活率为100%,复苏后细胞平均活率为(94.20±3.95)%,无菌检查和支原体检查合格;细胞在VP-SFM中复苏传代后生长良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第8天进入平台期,第12天达最大细胞密度20.5×10~5个/ml,并维持至第14天,活细胞数开始下降,最大μ值为0.025 4 h^(-1)。Vero细胞在无血清培养基中传代稳定性较好,140、150、160代Vero细胞在VP-SFM培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P>0.05);142、147、153代Vero细胞在VP-SFM培养的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P>0.05);140、150、160代Vero细胞在无血清和含血清培养基培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P>0.05)。在生物反应器微载体系统中,采用无血清培养基培养Vero细胞,细胞贴壁及生长状态良好。结论初步建立无血清、无动物源性物质的Vero细胞库,采用方瓶静置培养或微载体搅拌培养,细胞生长状态均良好,传代稳定性也较好。

响应面法优化MDCK-siat7e细胞培养工艺

目的以响应面法优化MDCK-siat7e细胞培养条件。方法以MDCK-siat7e细胞培养的起始氨浓度、乳酸浓度、渗透压和活细胞密度（viablecelldensity，VCD）为因子，以MDCK0siat7e细胞培养的72h细胞比生长率、细胞活率、乳酸比生成率和氨比生成率为响应值，采用全因子实验设计和响应面分析来研究这些因子对M1X；K-siat7e细胞培养的影响。结果在MDCK-siat7e细胞培养过程中，对72h细胞比生长率有显著影响的因子是起始VCD（t=3．43，P〈0．05）；对72h细胞活率有显著影响的因子是起始乳酸浓度（t=4．32，P〈0．05）和氨浓度（f=2．86，P〈0．05）；对72h乳酸比生成率有显著影响的因子是起始乳酸浓度（t=8．92，P〈0．05）、渗透压（t=4．11，P〈0．05）和VCD（t=2．66，P〈0．05），其中乳酸浓度起主要作用；对72h氨比生成率有显著影响的因子是起始氨浓度（t=2．63，P〈0．05）。结论用响应面法优化MDCK-siat7e细胞培养工艺可对该细胞培养过程中的条件控制起指导作用。

浅谈狂犬病毒免疫机制

狂犬病毒引起的免疫应答是由多因素参与和多种方式共同作用的结果,不仅涉及病毒中和抗体(virus neutralization antibody,VNAb)的产生和细胞毒性T细胞(CTL)作用,而且细胞因子,免疫分子亦发挥重要作用。