A型肉毒神经毒素单克隆抗体的制备与化学发光酶免疫检测技术的应用

从A型肉毒神经毒素杂交瘤细胞中提取单抗基因并在哺乳动物系统中表达纯化,制备A型肉毒神经毒素单克隆抗体。应用化学发光酶免疫分析技术(CLEIA),建立A型肉毒神经毒素快速检测方法。通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)检测杂交瘤细胞序列,以含有单抗基因的质粒为模板进行亚克隆,分别构建轻重链的表达质粒并转到JM108克隆菌株中,后通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒,再将质粒转染到哺乳动物细胞CHO中进行表达,最后亲和层析Protein G柱纯化抗体。利用双抗体夹心原理,优化出CLEIA法最佳检测方案。建立A型肉毒神经毒素CLEIA检测方法,并对该分析方法的检测限、专属性、耐用性逐一进行验证。制备了A型肉毒神经毒素单克隆抗体且建立了A型肉毒神经毒素快速检出方法,检测限为0.156 ng/mL;A型肉毒神经毒素与其他型别无交叉反应且其在不同溶剂介质中检测限不受影响,显示出良好的特异性和耐用性。应用该方法证明了100 U衡力^(Ⓡ)注射用A型肉毒毒素成品在0.02 mol/L,pH=7.8磷酸缓冲液中复溶检测效果最佳。本研究制备的A型肉毒神经毒素单克隆抗体和建立的A型肉毒神经毒素CLEIA检测方法具有良好的实用性,为A型肉毒神经毒素的临床检测及质控分析提供另一种思路和方法。

A型肉毒神经毒素双抗体夹心ELISA的建立及验证

目的 建立A型肉毒神经毒素双抗体夹心ELISA快速定量检测方法,并进行验证及初步应用。方法 通过杂交瘤细胞培养技术制备鼠抗A型肉毒神经毒素单克隆抗体,用ELISA及其他免疫学方法测定抗体效价、亚型及理化性质。优化出最佳试验方案,建立定量检测A型肉毒神经毒素的双抗体夹心ELISA,并对该方法的线性及范围、定量限、准确性、精密度(重复性、中间精密度)、专属性和耐用性进行验证。对本公司相关产品进行测试。结果 制备的A型肉毒神经毒素单克隆抗体纯度为88.15%,效价为1∶102 400,重链亚型为IgG1类,轻链为Kappa类;可与A型肉毒神经毒素的重链特异性结合。建立的A型肉毒神经毒素双抗体夹心ELISA在5.000~80.000 ng/mL范围内线性良好(r>0.99);定量限为2.500 ng/mL;准确度介于80%~115%;CV<15%;该方法与破伤风毒素、B、C、D、E和F型肉毒甘油毒素均无交叉;且A型肉毒神经毒素产品复溶后在2~8℃储存3 d,检测结果不受影响。应用该方法检测本公司开发的新型A型肉毒神经毒素产品,结果符合预期。结论 制备了鼠抗A型肉毒神经毒素单克隆抗体,建立了特异性好且灵敏度较高的A型肉毒神经毒素双抗体夹心ELISA,为A型肉毒神经毒素产品质量控制提供参考价值。

肉毒毒素制剂免疫原性的研究进展

肉毒毒素(botulinum toxin)是肉毒杆菌(clostridium botulinum)产生的蛋白质,能够抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放,从而达到化学性去神经支配作用。根据这一特性,肉毒毒素被用于治疗多种疾病,并且具有多个美容适应症。肉毒毒素共有7种血清型(A-G),目前仅A、B血清型应用于临床。肉毒毒素作用平均维持3~6个月,患者通常需要接受反复治疗以维持疗效,这也使少数患者不可避免地受到肉毒毒素制剂免疫原性的影响。研究表明,肉毒毒素制剂的免疫原性造成患者出现中和抗体(neutralizing antibodies, NAbs)或继发性无应答(secondary non-response, SNR)是治疗效果不佳的原因之一。现就肉毒毒素结构、毒素各组分潜在的免疫原性及免疫原性对临床治疗的影响作一概述。