基于PacBio SMRT技术的婴幼儿配方奶粉微生物安全性评价

目的:婴幼儿配方奶粉中的大量细菌已被灭活,然而灭活微生物仍影响产品品质和货架期。现行纯培养技术只能对食品基质中活菌进行检测,无法全面评估污染微生物组成,而基于宏基因组学策略能够对婴幼儿配方奶粉加工过程中污染微生物进行全面客观的评价。方法:采集6份婴幼儿配方奶粉,使用细菌纯培养、单分子实时测序技术(PacBio SMRT)和微滴式数字PCR(ddPCR)联用技术对其污染微生物组成进行评价。结果:采用纯培养技术在样品中均未检测到大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌和芽孢。使用PacBio SMRT测序技术,在婴幼儿配方奶粉中共鉴定出14个细菌门、138个细菌属和255个细菌种。其中6份样品均存在过嗜冷菌蜡样芽孢杆菌,其平均相对含量高达23.54%,这一灭活的细菌也会影响产品货架期。此外,在IF3、IF4、IF5和IF6样品中,检测到相对含量较低的致病菌大肠杆菌,其相对含量分别为0.06%,0.01%,0.15%和0.05%。采用ddPCR技术对SMRT测序方法检测到的致病菌蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌进行定量分析,发现每克奶粉样品中蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌的平均拷贝数取对数后分别为5.45和4.89。结论:在6份婴幼儿配方奶粉中均未检出致病菌,符合食品安全国家标准,然而奶粉中被灭活的蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌可能增加产品腐败的风险,影响产品的货架期。本研究结合多个技术全面评价婴幼儿配方奶粉的微生物污染情况,初步建立婴幼儿配方奶粉的微生物检测技术。

普拉梭菌的生物学特性及其与宿主的相互作用

概述普拉梭菌的生物学特性及其与炎症性肠病、肠易激综合征、结直肠癌、肥胖和Ⅱ型糖尿病等疾病的相关性研究,讨论宿主生理、病理条件对普拉梭菌的影响以及普拉梭菌对宿主的益生作用。

叠氮溴化丙锭结合实时荧光定量PCR技术检测发酵乳中植物乳杆菌P-8活菌数

采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合实时荧光定量PCR对乳制品中活菌DNA进行定量分析,建立一种快速而准确检测发酵乳品中植物乳杆菌P-8(Lactobacillus plantarum P-8)活菌数的新方法。通过对影响PMA作用的浓度、暗孵育和曝光时间等因素进行试验,确定最佳PMA处理方案。结果表明:L. plantarum P-8经80℃处理60 s,即为膜损伤菌;当PMA质量浓度为40μg/m L,暗孵育时间10 min,曝光时间为20 min时,PMA既不影响活菌DNA的PCR扩增,又能渗透进入细胞膜受损的死菌并抑制其PCR扩增;通过制备L.plantarum P-8质粒标准品并建立标准曲线,其表现出良好的线性关系,相关系数(R2)为0. 992 9,最低检测限为103CFU/m L,特异性良好。该方法为完善发酵乳产品益生菌活菌数的检测奠定了基础。

瑞士乳杆菌MG9-2微胶囊的制备工艺优化及其性能分析

以乳蛋白为壁材,利用内源乳化法制备瑞士乳杆菌MG9-2微胶囊,对其进行工艺优化,并比较添加不同钙盐作为交联剂(CaCl_2和CaCO_3)对微胶囊性能的影响。结果显示制备瑞士乳杆菌MG9-2微胶囊的最佳工艺参数为:乳化搅拌速率800r/min、水油比1∶10、脱脂乳质量浓度0.35g/mL、钙盐浓度1.5mol/L。在此条件下以CaCO_3、CaCl_2为交联剂制得MG9-2微胶囊的包埋率分别为(78.4±3.6)%和(75.7±4.9)%,无显著性差异。但与CaCl_2为交联剂制得的MG9-2微胶囊相比,CaCO_3制得的微胶囊粒径较小,表面较致密、形状较规则、分散性较好,且具有较好的肠液释放性和耐胃酸性。结果表明,以CaCO_3为交联剂在室温制备瑞士乳杆菌MG9-2微胶囊的工艺简单且性能较好。

Lactobacillus reuteri IMAU10240增殖培养基及高密度培养工艺优化

Lactobacillus reuteri IMAU10240(L.reuteri IMAU10240)是一株具有潜在益生特性的乳酸菌,为实现产业化应用,对其培养工艺进行优化以提高其活菌数。本研究以MRS培养基为基础,通过单因素筛选试验、正交试验和响应面优化试验对该菌株的培养基以及培养条件进行优化。通过实验确定L.reuteri IMAU10240最适培养基:蔗糖100.00 g/L,大豆蛋白胨13.25 g/L,酵母粉8.84 g/L,酵母蛋白胨13.25 g/L,Na_2HPO_4 19.85 g/L,柠檬酸2.58 g/L,MnSO_4·5H_2O 0.12 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.40 g/L,甘油2.76 g/L,吐温-80 1.00 g/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.50 g/L。初始pH 6.5,通入氮气37℃恒pH 5.5培养7~8 h。利用优化好的配方工艺进行5 L/50 L/200 L发酵罐的小试及中试试验,验证L.reuteri IMAU10240的发酵工艺,活菌数为7.57×10~9 CFU/mL,冻干菌粉活菌数为2.59×10^(11) CFU/g,可以进行生产验证。

嗜酸乳杆菌IMAU30067增殖培养基的研究

嗜酸乳杆菌IMAU30067是分离自新疆传统酸马奶中的一株具有潜在益生特性的乳酸菌。本研究针对嗜酸乳杆菌IMAU30067的营养需求,通过增殖培养基优化,获得其高密度培养条件。采用单因素试验、正交试验以及响应面法对嗜酸乳杆菌IMAU30067的培养基成分以及静态培养条件进行优化。通过优化得到嗜酸乳杆菌IMAU30067的最佳增殖培养基为:葡萄糖30.00 g/L、麦芽糖30.00 g/L、海藻糖20.00 g/L、鱼蛋白胨30.00 g/L、大豆蛋白胨10.00 g/L、柠檬酸钠2.29 g/L、乙酸钠5.74 g/L、K_2HPO_42.29 g/L、MgSO_4·7H_2O 0.80 g/L、马铃薯提取物6.00 g/L、组氨酸0.10 g/L。最佳培养条件为:接种量1×10~6CFU/mL、初始pH值6.5,于37℃恒pH5.0厌氧培养。最后利用5L发酵罐进行小试发酵试验,优化后IMAU30067的活菌数达3.72×10~9CFU/mL。通过对IMAU30067增殖培养基及培养条件的优化,IMAU30067活菌数较MRS基础培养基提高了82.6倍,为其高密度培养奠定了基础。

基于UPLC-Q-TOF-MS的植物乳杆菌P-8发酵乳代谢物轮廓分析

代谢组学是对生物体受外部刺激所产生的小分子代谢产物的变化或其随时间的变化进行研究的一门学科。本实验采用超高效液相色谱和四级杆飞行时间串联质谱技术结合PCA分析了植物乳杆菌P-8发酵乳的代谢物图谱。结果表明:通过代谢组学的分析方法共鉴定152个代谢物,差异代谢物主要为有机酸16种(琥珀酸、柠檬酸和顺乌头酸等)、多肽20种(Thr-Val、Asn-Pro、Val-Asn、Asn-Thr、Asn-Leu、Trp-Ala和Try-Ser等)、游离氨基酸12种(半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸和酪氨酸等)和核酸代谢物8种(7H-Purine、Cytidine和Pyrimidine等)。因此,利用此方法能够对发酵乳代谢物进行鉴定和分析,并作为其潜在的生物标记物。

植物乳杆菌P-8发酵乳的代谢物图谱

发酵乳是由上百种生物分子组成的一个复杂的食品体系,目前没有单一的分析平台能够完整地测定其所有的代谢物。本试验通过监测植物乳杆菌P-8单菌发酵乳和植物乳杆菌P-8与商业发酵剂YC-X11复配发酵乳的发酵特性,采用超高效液相色谱和四极杆飞行时间串联质谱技术结合统计学方法分析发酵乳的代谢物图谱。试验结果表明,植物乳杆菌P-8与商业发酵剂YC-X11复配发酵所需时间为5 h,远远少于植物乳杆菌P-8发酵所需时间(13 h);复配发酵乳活菌数、滴定酸度均显著增加(P<0.05)。通过代谢组学的分析方法,共鉴定出62种代谢物,主要差异代谢物为有机酸(7种)、多肽(4种)、游离氨基酸(4种)、核酸代谢物(4种)和芳香类物质(3种)等。利用代谢组学方法能够对发酵乳代谢物进行鉴定和分析,并作为其潜在的生物标记物。

益生菌山药饮料发酵工艺优化及其冷藏稳定性

本研究以山药粉为原料,益生菌Lactobacillus plantarum P-8和Bifidobacterium lactis V9为发酵剂,对发酵工艺进行优化,以得到一种兼具山药营养价值与益生菌益生特性的益生菌山药饮料。通过单因素实验研究发酵时间、接种量、发酵温度对饮料中活菌数、滴定酸度以及pH的影响,在此基础上结合响应面分析获得发酵益生菌山药饮料最优发酵工艺参数,即接种量为2×10^6 CFU/mL、发酵时间为19.1 h、发酵温度为37℃。在此条件下饮料活菌数为4.3×10^8 CFU/mL,滴定酸度为105.3°T。对饮料在4℃下贮藏28 d,贮藏期内饮料活菌数稳定维持在10^8 CFU/mL,饮料组织状态良好、风味及口感稳定。

阿尤恩地区自然发酵牛乳中乳酸菌分离鉴定及多样性研究

为了分离、保藏自然发酵乳中乳酸菌菌种,丰富自然发酵乳中乳酸菌多样性信息。本文采用传统的纯培养分离方法和宏基因组16S rRNA基因测序技术对阿尤恩地区自然发酵牛乳的乳酸菌多样性进行研究。纯培养结果表明:5份自然发酵牛乳中共分离出111株乳酸菌,鉴定为5个属10个种,其中Lactococcus lactis,占总分离株的45.95%;宏基因组测序结果发现,5份样品中的细菌归属于8个门、66个属和131个种,其中优势菌门为Firmicutes(69.63%),优势菌属为Lactococcus(31.80%),优势菌种同样为Lactococcus lactis(22.95%),另外还检测到含量较高的Streptococcus thermophilus(17.12%)、Lactobacillus helveticus(14.44%)等菌种。通过分析发现,Lactococcus lactis为阿尤恩地区5份自然发酵牛乳样品的优势菌种,并且自然发酵牛乳样品中细菌种类丰富,样品间细菌组成存在相似性和差异性。

俄罗斯卡尔梅克共和国传统奶酪中细菌多样性研究

俄罗斯传统奶酪生产历史悠久、工艺独特,其中蕴含着丰富的微生物。本研究采用454焦磷酸测序技术对俄罗斯卡尔梅克共和国的6份传统奶酪进行分析。结果表明,6份样品共鉴定出7个细菌门、50个细菌属。优势菌门为硬壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),优势菌属以乳球菌属(Lactococcus)和链球菌属(Streptococcus)为主,但R5号样品的优势菌属为柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和不动杆菌属(Acinetobacter)。个别样品中检测到了含量较低的有害微生物如漫游球菌属(Vagococcus)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)等。通过主坐标分析发现,采自同一地区的R1-R4号样品在菌群结构上较为接近,因此初步判断地理区域因素可能是影响传统奶酪中细菌构成的重要因素。

食品工业中噬菌体灭活方法研究进展

现代发酵食品工业中,杂菌和噬菌体污染是造成产品发酵失败的主要原因。因此,控制噬菌体污染和对潜在噬菌体进行灭活处理对食品加工业至关重要。本文比较分析了食品工业中常用物理化学方法(热处理、高压、光化学、高压脉冲电场、臭氧等)对噬菌体的灭活效果,以期为有效预防及控制噬菌体污染提供一定的理论依据。

乳双歧杆菌Probio-M8氧气耐受性驯化研究

氧气对双歧杆菌具有毒性作用,导致菌体活力受损,限制其生产及应用。为提高双歧杆菌对氧气的耐受性,采用改变培养基中氧分压的方法对乳双歧杆菌Probio-M8进行氧气耐受性驯化。通过测定生理特性、氧气耐受性相关NADH氧化酶活性及细胞膜流动性变化,评价氧气对乳双歧杆菌Probio-M8的影响。结果表明:氧气耐受性驯化后1000代菌株与原始菌株相比在有氧及厌氧环境中,pH值显著下降0.23和0.27(P<0.05),产酸能力明显提升;RBGR值、NADH氧化酶活性显著上升0.47和31.14 U(P<0.05),氧气耐受性明显增强;不饱和脂肪酸含量显著上升17.26%(P<0.05),细胞膜流动性增强。氧气耐受性驯化后乳双歧杆菌Probio-M8的氧气耐受性明显增强,为其在食品中应用及开发提供借鉴。

Lactobacillus buchneri IMAU80233高密度发酵工艺优化

以工业化生产为出发点,对具有潜在益生特性Lactobacillus buchneri IMAU80233高密度培养工艺进行优化。采用Bioscreen C读值系统,在MRS培养基的基础上,对适合L.buchneri IMAU80233生长增殖培养基成分进行快速筛选优化。优化后最适培养基为果糖80 g/L,大豆蛋白胨23.90 g/L,酵母粉11.90 g/L,柠檬酸1.59 g/L,柠檬酸钠20.06 g/L,MnSO4·5H2O 0.09 g/L,MgSO4·7H2O 0.60 g/L,精氨酸0.50 g/L,吐温-801.00 g/L。采用5 L×3联发酵罐进行小试,确定初始pH值为6.5,37℃恒定pH 5.9培养20 h,发酵初期通入氮气,优化后发酵液活菌数达3.81×10^9 CFU/mL。

双歧杆菌分离株的耐药性评价

目的:测定20个双歧杆菌菌株对15种抗生素的最低抑菌浓度,检测菌株的耐药性基因及其是否转移。方法:采用肉汤稀释法对20株双歧杆菌菌株进行15种抗生素最小抑制浓度的检测,最终通过聚合酶链式反应检测菌株是否含有与15种抗生素相关的耐药性基因,并进一步通过滤膜杂交法测定耐药性基因是否转移。结果:在双歧杆菌分离株之间,最小抑菌浓度有显著差异;同一种的双歧杆菌最小抑菌浓度也不尽相同。所有双歧杆菌菌株对氨苄西林、庆大霉素、链霉素、利奈唑胺敏感,对卡那霉素有内在抗性;各菌株对氯霉素、环丙沙星、克林霉素、红霉素、新霉素、四环素、甲氧苄啶、万古霉素的敏感性存在差异。聚合酶链式反应分析表明,部分双歧杆菌中含有tet(W)。然而,滤膜杂交试验表明:含有抗性基因的菌株,抗性基因并不会发生转移,菌株具有安全性。结论:双歧杆菌与抗生素耐药性细菌无关,20株双歧杆菌是安全菌株。

全基因组关联分析在乳酸菌研究中的应用

乳酸菌是重要的工业用微生物之一,广泛用于食品发酵、医疗保健等领域。乳酸菌也是肠道内的有益微生物,具有改善胃肠道环境,维护肠道菌群平衡的作用。全基因组关联分析的出现为乳酸菌的分离筛选以及溯源、进化研究提供了更为可靠的证据和新的思路。本文简述乳酸菌分子生物学研究的必要性,介绍全基因组关联分析的历史以及在细菌中应用的现状,展望该技术在乳酸菌研究中的应用以及面临的困难和解决方法。

利用单细胞扩增技术解析母婴间肠道微生物构成及功能

微生物在人体中扮演重要角色,而婴儿早期微生物对日后健康发育至关重要.微生物可通过产道和母乳这2种主要途径从母亲传递给婴儿.本研究利用单细胞扩增技术对3对母婴粪便样品(共48份细菌悬液)进行宏基因组测序分析,旨在探究母婴间肠道微生物构成并对相关功能基因作出分析.结果显示,每对母婴间微生物尽管含量不同,但种类都高度相似(>99%).三婴儿中,一个顺产婴儿显示与其母亲有相似的高丰度物种,如Roseburia hominis,Roseburia intestinalis,Eubacterium rectale,Eubacterium eligens等;另2个剖腹产婴儿显示与皮肤、口腔相关的高丰度物种,如Propionibacterium acnes,Staphylococcus saprophyticus/S.haemolyticus,Delftia acidovorans等.剖腹产婴儿中拟杆菌少于顺产婴儿,如Bacteroides(B.)fragilis,B.helcogenes,B.salanitronis等.本研究共检测到1283种细菌,除常见的人体肠道微生物外,还检测到4个低丰度物种,分别是Lactobacillus(L.)amylovorus,L.kefiranofaciens,L.sanfranciscensis和Bifidobacterium asteroids.粪便样品功能宏基因组显示,婴儿粪便中富有与碳水化合物相关的磷酸转移酶系统(PTS)和β-葡萄糖苷酶基因.本研究初次使用单细胞扩增技术对母婴间肠道微生物组成及功能做出探索,获得了较高测序深度及物种多样性,发现了之前鲜有报道的低丰度物种,证实单细胞扩增技术可用于后续不同生态环境微生物领域的研究.

抗噬菌体P2的植物乳杆菌突变菌株的筛选及其吸附特性研究

以分离自植物乳杆菌异常发酵液的烈性噬菌体P2及其宿主Lactobacillus plantarum IMAU10120为研究对象,采用次级感染法筛选自发突变抗噬菌体菌株。对比突变株与野生株吸附特性,判断细胞生理状态对噬菌体吸附能力的影响。采用十二烷基硫酸钠、溶菌酶、蛋白酶K和三氯乙酸分别处理细胞壁,确定噬菌体P2的吸附位点。结果表明:成功筛选出1株抗噬菌体P2的植物乳杆菌突变株,且具有稳定的遗传耐受力。突变株与敏感株的吸附率均在97%以上,表明噬菌体吸附受体未发生改变。细胞生理状态对噬菌体吸附能力无显著差异。推断噬菌体P2的吸附受体可能与多糖-肽聚糖聚合物有关。

分子生物学法快速筛选具有优良产酸特性的嗜热链球菌

目的:嗜热链球菌具有优良的发酵特性及生物学功能,是发酵乳制品中常用的发酵剂之一。由于高产酸菌株有助于提高生产效率,因此在工业生产中备受亲睐。方法:通过发酵乳的发酵试验,结合分子生物学技术对分离自自然发酵乳产品中的28株嗜热链球菌进行了筛选。结果:共筛选出5株高产酸菌株,分别是IMAU80844、IMAU80809、IMAU10636、IMAU80287、IMAU80846。基于产酸基因序列构建的系统发育树与发酵试验结果一致,可将高产酸菌株和低产酸菌株区分开,进一步验证了结果的可靠性。结论:本试验结果证实分子生物学方法能够快速筛选具有优良产酸特性的嗜热链球菌菌株,为今后筛选高产酸菌株提供新思路。

益生菌与肠-器官轴的相互作用

肠道微生物是人体重要的外源“器官”,与免疫、营养、代谢等诸多生理功能紧密相关。利用宏基因组测序已经阐明肠道微生物与人类健康之间的复杂关系,研究发现肠道菌群与脑、肺、肝、肾、皮肤和口腔之间建立了错综复杂的双向关系。肠道菌群组成及其代谢物的变化与各种代谢异常有关,包括肥胖、糖尿病、神经性疾病、呼吸系统疾病和心脏代谢异常。细菌的代谢产物也会影响不同的器官,进而可能直接或间接调节生理和病理过程。益生菌生物疗法可通过平衡体内微生物的数量和促进良好的新陈代谢来创造健康的肠道环境,进而对这些疾病产生有益影响。这表明施用益生菌调节肠道微生物可能被视为未来的“新”治疗靶点。