内蒙古地区羊源副结核分枝杆菌的分离与基因分型

【目的】副结核病被世界动物卫生组织(OIE)列入必须报告的《OIE疫病、感染及侵染名录》,我国将其列为二类动物疫病,引起多种反刍动物慢性、增生性肠炎,感染动物通过肠道间歇性排菌而成为养殖场的持续传染源,给养殖业带来了巨大经济损失。其病原体副结核分枝杆菌(MAP)属于胞内寄生的革兰氏阳性菌,为三类动物病原微生物,包括S型(羊型,细分为Ⅰ型、Ⅲ型和骆驼型)和C型(牛型、Ⅱ型,包括B型(野牛型))。有研究表明,各亚型MAP无宿主特异性,但具有地域性,内蒙古作为国内该病的首发地区,获得并准确鉴定内蒙古地区MAP菌株亚型及基因特征,对副结核病的预防控制意义重大。【方法】对内蒙古地区来源的28份MAP阳性的羊源病料进行MAP分离培养,菌落Ziehl-Neelsen染色,染色阳性菌扩繁,提取扩繁菌液基因组DNA,进行IS900基因、IS1311基因和DMC基因扩增、测序和序列分析,同时IS1311基因PCR产物进行Hinf I和Mse I双酶切鉴定。【结果】28份样品经过7—12周培养,共有9支培养基长出菌落,菌落半透明乳白色、表面光滑。挑取单菌落进行抗酸染色,在显微镜下观察到呈不规则(单个或分枝状)、红染的细短杆菌,符合分枝杆菌的形态学特征及抗酸染色特性。9株分离菌IS900、IS1311和DMC基因PCR扩增产物均与目的基因片段预期大小一致。确定了本研究9株分离株均为MAP菌株,分别命名为MAP-NM1至MAP-NM9。DMC基因扩增产物大小为310bp,符合Ⅱ型MAP特征;IS1311基因扩增产物经HinfⅠ和MseⅠ双酶切,本研究9株MAP均得到4条目的条带,与Ⅱ型MAP一致;IS1311基因测序结果与S型、C型、印度野牛型和美国野牛型MAP代表株对照分析显示,9株MAP IS1311基因片段的64、65、68、223、236、422、527、628位碱基位点符合C型和B型MAP特征;IS900基因测序结果序列分析显示,9株MAP IS900基因片段第169位及第216位碱基分别为C(胞嘧啶)和A(腺嘌呤),符合Ⅱ型和Ⅲ型MAP特征;17株来自GenBank数据库的MAP IS900基因参考序列与本研究9株分离株IS900基因系统进化树显示,本研究9株MAP均划分于Ⅱ型MAP分支;3个基因测序结果进行Blast在线分析,与本研究所得分离株同源性最高的参考序列均为Ⅱ型MAP,且同源性均高于98%。综上所述,本研究9株MAP分离株均为Ⅱ型MAP。【结论】首次分离得到内蒙古地区羊源Ⅱ型MAP菌株。

捕食性真菌与植物单宁联合制剂对绵羊消化道线虫的杀灭效果

为了测试捕食线虫性真菌(Duddingtonia flagrans)及植物单宁对绵羊消化道线虫的杀灭效果,在制备伊维菌素、捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans及植物单宁片剂与联合制剂的基础上,进行了绵羊消化道线虫的防控试验,并通过EPG的计数评测驱虫效果。结果表明,成功制备了生物制剂与药物的联合制剂,动物试验表明该制剂具有一定杀虫效果。试验发现单宁酸有一定驱线虫作用;植物单宁、驱虫药与捕食性真菌联合制剂的防治效果优于单一组分组。试验结果为绵羊消化道线虫防治提供了新方法,为植物源杀虫活性物质研究提供了参考数据。

猫传染性腹膜炎病毒的检测及ORF 7 ab、N和S基因遗传进化分析

采用剖检、组织病理学和免疫组织化学的方法检测并确诊了2例猫传染性腹膜炎(FIP)病例,并通过RT-PCR扩增2例组织样品中猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的ORF 7 ab、N和S基因,测序后进行基因遗传进化分析,阐明病毒的遗传进化特征。结果显示,2个病例均表现典型的混合型FIP的大体病变,腹腔积满浆液纤维素性渗出物,在腹腔浆膜面散在或弥漫分布细小的灰白色结节。组织病理学显示腹膜表面上附着大小不等的炎性细胞浸润灶,以及坏死性肠炎、间质性胰腺炎和间质性肺炎。免疫组织化学染色结果显示,FPIV特异性的强阳性信号见于炎性细胞浸润灶、脾脏和胰腺内。基因同源性和遗传进化分析结果显示,2例基因均属于FCoVⅠ型。IMAU No.11685与浙江杭州ZJU1709毒株(MT239440)同源性最高,亲缘关系最近;IMAU No.11824与湖北武汉QS毒株(MW030108)同源性最高,亲缘关系最近。说明2例FIPV与国内流行毒株起源于共同祖先,其中ORF 7 ab、N基因相对保守,变异不明显,S基因发生一定的变异。研究结果可为我国FIP的分子流行病学研究和防控提供参考。

骆驼胎盘提取物对小鼠免疫功能和巨噬细胞极化的影响

为了探究骆驼胎盘提取物(camel placenta extract,CPE)的免疫作用及其对巨噬细胞极化的影响,本研究将60只BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组和试验组。试验组小鼠又分为CPE高、中、低剂量(1.2、0.6、0.3 mg/mL)组,腹腔注射CPE连续14 d。除空白对照组外,其余组小鼠试验结束前7 d注射环磷酰胺致免疫抑制。通过ELISA、流式细胞术、组织病理学、荧光定量PCR和Western blot方法分别检测各组小鼠血浆IgG、细胞因子、淋巴细胞亚群、淋巴器官形态学变化以及腹腔巨噬细胞表面分子iNOS、CD206的mRNA和蛋白表达水平,以评估CPE对小鼠免疫功能和巨噬细胞极化的影响。结果显示,试验组小鼠的脾脏和胸腺指数,CD19^(+)、CD40^(+)细胞百分比和IgG水平均显著高于模型对照组(P<0.05);与模型对照组相比,试验组CD4^(+)、CD8^(+)细胞百分比和IL-4水平显著升高(P<0.05),而IL-2水平极显著降低(P<0.01);试验组巨噬细胞CD206 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),而iNOS的表达无显著变化。以上结果表明,CPE对小鼠T、B细胞功能以及抑炎表型巨噬细胞极化均具有促进作用。

牛嵴病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、准确且能定量分析牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKoV)的检测方法。【方法】根据GenBank上发布的牛嵴病毒3D基因序列设计合成一对特异性引物和一条探针,通过优化反应体系建立牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,并对临床样品进行检测。【结果】该方法最佳上下游引物浓度均为300nmol·L^(-1),探针浓度为400 nmol·L^(-1),在1×10^(1)~1×10^(8)copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.999,扩增效率为103%;特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出牛嵴病毒;敏感性较高,对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(1)copies·μL^(-1),而普通RT-PCR对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(2)copies·μL^(-1);重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。2021年3~5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BKoV的检出率为24.3%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为3.7×10^(5)copies·μL^(-1),健康犊牛粪样平均病毒载量为8.65×10^(3)copies·μL^(-1)。【结论】建立的牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BKoV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。

枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

[目的]探究枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。[方法]采用Cell Counting kit-8(CCK-8)方法筛选对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌培养上清液刺激浓度范围与刺激时间范围。用筛选出的无明显毒性作用的不同浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs 8 h后,采用荧光定量PCR(qPCR)技术和酶联免疫吸附(ELISA)检测方法筛选枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度,以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间。[结果]①对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌对应的培养上清液浓度范围为10^(7)~10^(11) CFU/mL,刺激时间范围为2~24 h。②利用qPCR技术和ELISA检测方法筛选出最佳刺激浓度为10^(11) CFU/mL枯草芽孢杆菌对应的培养上清液。③以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间为24 h。[结论]枯草芽孢杆菌培养上清液可以诱导ORECs SBD-1的表达。

布鲁氏菌A19疫苗株全基因组测序及比较基因组学分析

目的探索布鲁氏杆菌A19疫苗株全基因组的结构、分子生物学的功能,并对其生物信息学进行研究。方法采用Illumina Hiseq 4000和PacBio对A19进行全基因组测序,并与GenBank上的8株菌进行比较基因组学解析。A19基因组3286167 bp,预测3371个基因,GC含量57.25%。通过注释COG库,对应基因有2560个,将其归入22类COG中;根据比对KEGG库,得到2544个基因,共参与33类代谢通路。结果综合两个数据库结果发现,大多数A19预测基因中的基因功能主要与膜运输、氨基酸转运及碳水化合物代谢有关。结论通过分析发现,A19和猪羊牛种布鲁氏菌之间存在一定差异,并找出牛种毒力基因。本实验通过测序A19全基因组,为布鲁菌疫苗的研究提供思路。

牛磺鹅去氧胆酸对糖皮质激素受体的激活作用

旨在研究牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)对糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)的活化作用,进而阐明TCDCA作用机制。采用分子对接模拟TCDCA与GR的结合情况,并通过构建含有GFP标签的GR真核表达质粒,经瞬时转染HEK-293T细胞,观察TCDCA对GR核移位的影响。结果表明TCDCA(1mmol/L)可与GR发生结合并激活GR,产生核移位,证明TCDCA抗炎免疫调节作用与其活化GR信号通路相关。

捻转血矛线虫耐药相关基因P450原核表达及其生物信息学分析

为表达捻转血矛线虫P450蛋白并分析其生物信息学特性,本研究利用RT-PCR扩增捻转血矛线虫P450基因,构建重组质粒pET-P450,经双酶切鉴定,将其转化大肠杆菌后,采用SDS-PAGE检测P450蛋白的表达;利用生物信息学软件对P450蛋白的理化性质、结构特点进行分析。结果显示,正确构建了重组质粒pET-P450且P450蛋白以包涵体的形式表达。生物信息学分析结果显示,P450蛋白分子式为C1154H1812N314O330S15,为不稳定蛋白、无跨膜区、无信号肽,是一种含较多抗原表位的亲水性蛋白,有7个B细胞抗原表位和11个T细胞抗原表位,有望用作捻转血矛线虫耐药性的诊断抗原。本研究获得了P450重组蛋白,为捻转血矛线虫耐药性快速检测方法和新药开发奠定物质基础。

羊副结核病临床案例在家畜病理解剖学教学中的应用

家畜病理解剖学是一门实践性很强的临床性质课程,临床案例教学对提高课程的教学质量至关重要。笔者在兽医临床实践中积累了1例羊副结核病临床案例并以该案例进行教学,取得了良好的效果。通过对案例病理学诊断和发病机制分析,使学生掌握羊副结核病典型临床症状、病理变化和诊断要点以及疾病的诊断思路和方法,并运用萎缩、心功能不全、心力衰竭、水肿、坏死、增生性肠炎、增生性淋巴结、副结核杆菌、抗酸染色等病理学知识和事物运动发展的观点来分析疾病的病理变化和发病机理。通过本案例教学培养了学生认识病变、分析病变和诊断疾病的能力,同时也培养学生把病理学理论知识与实践相结合来分析病变、病理过程和发病机制的思路和方法。

4℃无氧保存时间对绵羊粪便中线虫卵孵化率的影响

为评估4℃无氧环境中绵羊粪便保存时间对虫卵孵化率的影响,将新鲜绵羊粪便混合均匀后,等分为8份保存,分别测定保存0、3、6、9、12、15、18和21d的虫卵孵化率。参考并改进世界兽医寄生虫学促进协会(WAAVP)推荐的虫卵孵化试验(egghatchtest,EHT)方法,收集线虫虫卵,用24孔培养板孵化虫卵进行重复性试验,记录线虫卵孵化率,并对数据进行统计分析。结果显示,4℃无氧环境中,保存9d内粪便的线虫卵孵化率可达到50.51%,9d后孵化率急剧下降。结果表明,4℃无氧环境中保存9d的新鲜粪便仍有50%以上的虫卵孵化率,可用于相关试验和研究。这种保存方法,延长了新鲜绵羊粪便采集后的有效使用时间,简便易行,对相关试验或研究提供了极大帮助。

棕色绿僵菌最适培养基和杀蝇蛆分生孢子浓度探究

为了研究昆虫寄生性真菌—棕色绿僵菌(Metarhizium brunneum)的最适培养基和杀蝇蛆分生孢子浓度,试验对棕色绿僵菌在不同固体培养基、液体培养基、氯化钠浓度和pH值条件下的生长特征和产孢能力进行了测定,并分别统计不同浓度(1×10^(4)个/mL、1×10^(5)个/mL、1×10^(6)个/mL、1×10^(7)个/mL和1×10^(8)个/mL)分生孢子悬液处理后第3,5,7天的蝇蛆累计死亡率。结果表明:棕色绿僵菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养第21天时的菌落直径最大(8.40 cm),然后从大到小依次为PPDA固体培养基(8.20 cm)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(8.10 cm)、枸橼酸固体培养基(7.20 cm)、大豆蛋白胨固体培养基(4.90 cm)、玉米粉琼脂培养基(4.70 cm);在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养第21天时的分生孢子产量最高(4.830×10^(7)个/mL),然后从高到低依次为PPDA固体培养基(3.070×10^(7)个/mL)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(1.770×10^(7)个/mL)、枸橼酸固体培养基(1.580×10^(7)个/mL)、大豆蛋白胨固体培养基(0.260×10^(7)个/mL)、玉米粉琼脂培养基(0.053×10^(7)个/mL);在萨氏液体培养基中培养第7天时的菌丝干重最高(10.6 mg/mL),然后从高到低依次为马铃薯液体培养基(8.0 mg/mL)、沙氏葡萄糖液体培养基(7.1 mg/mL)、玉米浸液液体培养基(0.2 mg/mL);在萨氏液体培养基中培养第7天时的分生孢子产量最高(5.29×10^(7)个/mL),然后从高到低依次为马铃薯液体培养基(2.86×10^(7)个/mL)、沙氏葡萄糖液体培养基(2.71×10^(7)个/mL)、玉米浸液液体培养基(1.53×10^(7)个/mL)。棕色绿僵菌在氯化钠浓度为0.15 mol/L或pH值为8的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养第21天时的菌落直径最大,分生孢子产量最高。用棕色绿僵菌分生孢子悬液(浓度分别为1×10^(4)个/mL、1×10^(5)个/mL、1×10^(6)个/mL、1×10^(7)个/mL和1×10^(8)个/mL)处理第3天,家蝇三期幼虫的累计死亡率为13.3%~40.0%;处理第5天,家蝇三期幼虫的累计死亡率为26.7%~66.7%;处理第7天,家蝇三期幼虫的累计死亡率为40.0%~90.0%。浓度为1×10^(6)个/mL、1×10^(7)个/mL和1×10^(8)个/mL的分生孢子悬液处理第7天时家蝇三期幼虫的累计死亡率显著高于浓度为1×10^(4)个/mL、1×10^(5)个/mL的分生孢子悬液(P<0.05),且浓度为1×10^(6)个/mL、1×10^(7)个/mL和1×10^(8)个/mL的分生孢子悬液处理第7天时家蝇三期幼虫的累计死亡率之间差异不显著(P>0.05)。说明棕色绿僵菌的最适培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基和萨氏液体培养基,培养基最适氯化钠浓度为0.15 mol/L、pH值为8;棕色绿僵菌分生孢子悬液对蝇蛆有较强的侵染杀灭作用,推荐的杀蝇蛆浓度为1×10^(6)个/mL。

基于gB蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法的建立

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotrachetitis virus,IBRV)的早期快速检测方法,并能判定免疫后是否再次发生感染,本研究利用原核表达IBRV gB蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot检测gB蛋白的表达,并初步建立基于gB蛋白检测IBRV的间接ELISA方法。结果表明:1)对IBRV标准阳性血清,本试验方法的最低检测限度为1∶4096,说明建立的gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性。2)该方法对其他4种常见的牛疫病阳性血清检测均为阴性,不存在交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。3)在对200头牛的临床样品的检测中,该方法与IDEXX(IBRV gB X3)抗体检测试剂盒符合率高达97.5%。综上,本研究建立的gB-ELISA检测方法敏感性高,特异性好,该方法为开发一种在感染早期快速对疾病进行诊断,并可以判定疫苗免疫后是否再次发生IBRV感染的试剂盒奠定基础。

捻转血矛线虫耐药虫株与敏感虫株circRNAs差异表达分析

为分析捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株与耐药虫株之间差异表达的circRNAs在调控耐药性中的作用,本研究以捻转血矛线虫敏感虫株和耐药虫株为研究对象,采用Illumina Hiseq 2000平台进行高通量测序及cDNA文库的构建,利用相关生物信息学软件对测得的circRNAs进行差异性分析,同时对来源基因进行GO和KEGG pathway功能富集。运用TargetScan和Miranda软件预测关键circRNAs靶向的miRNAs,探究circRNAs-miRNAs的作用。随后又随机选取5个显著差异的circRNAs,进行RT-qPCR检测并与转录组测序结果进行一致性评定。结果显示:1)敏感虫株与耐药虫株共筛选出677个差异表达的circRNAs,其中47个显著差异,23个显著上调,24个显著下调。2)所有差异circRNAs的来源基因GO富集分析显示,共富集到生物过程336个、细胞组分59个和分子功能110个,主要与代谢过程、细胞膜结构和催化活性等相关,KEGG富集分析显示,富集到257条通路,主要与代谢(脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢和丙酸代谢)、胰高血糖素信号通路和AMPK信号通路等相关。3)circRNAs-miRNAs调控网络分析显示,627个差异circRNAs靶向结合187个miRNAs,组成了10602组调控关系。综上,本研究成功筛选了捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株间差异表达的circRNAs,对所有差异circRNAs的来源基因进行功能注释和富集分析,并构建了部分显著差异circRNAs-miRNAs调控网络。本研究结果为捻转血矛线虫耐药性产生的分子机制研究提供了新思路。

Nesfatin-1对肥胖大鼠慢性炎症影响的研究

为了探究Nesfatin-1对肥胖大鼠慢性炎症的影响,试验以健康SPF级雄性SD大鼠为对照组,通过高脂饮食诱导肥胖大鼠模型,并将造模成功的28只肥胖大鼠随机分为模型对照组(生理盐水)、Nesfatin-1低剂量(1μg/kg)组、Nesfatin-1中剂量(10μg/kg)组和Nesfatin-1高剂量(100μg/kg)组,每组7只。Nesfatin-1低、中、高剂量组大鼠连续尾静脉注射不同浓度Nesfatin-1,5周后测量体重、体长,计算Lee’s指数,取肝脏并进行H.E.染色观察病理变化;采用ELISA法检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)含量的变化;运用qPCR法检测各组大鼠肝脏miR-155-5p和miR-146a-5p的相对表达量,以评估Nesfatin-1对慢性炎症的调节能力。结果表明:模型对照组大鼠的体重和Lee’s指数均极显著高于对照组(P<0.01)。不同浓度的Nesfatin-1均极显著抑制肥胖大鼠的体重增长(P<0.01),并且对肝脏脂肪变性有改善作用。与模型对照组比较,Nesfatin-1低剂量组炎症因子TNF-α含量显著降低(P<0.05),Nesfatin-1低、中、高剂量组抗炎细胞因子IL-10含量均显著升高(P<0.05);Nesfatin-1高剂量组miR-155-5p相对表达量显著降低(P<0.05),Nesfatin-1低剂量组miR-146a-5p相对表达量显著升高(P<0.05),Nesfatin-1高剂量组miR-146a-5p相对表达量极显著升高(P<0.01)。说明Nesfatin-1能够通过抑制肥胖大鼠体重增长、肝脏脂肪变性调节肥胖大鼠血清炎症因子水平和肝脏中miR-146a-5p、miR-155-5p的相对表达量。

白色脂肪棕色化及其与疾病的相关性研究进展

脂肪组织主要包括白色脂肪组织和棕色脂肪组织。白色脂肪组织的主要功能是储存能量,棕色脂肪组织的主要功能是产热耗能。白色脂肪棕色化的信号通路复杂多样,其相关的转录因子有过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)、PR结构域蛋白16(PR domain containing 16, PRDM16)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, PGC-1α),同时也受骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)和鸢尾素(irisin)的调节。白色脂肪棕色化能够激活米色细胞,增加机体的产热耗能,是治疗肥胖、胰岛素抵抗、脂肪肝、心脑血管疾病等的新方向。然而,白色脂肪棕色化是一把双刃剑,可能引起动脉粥样硬化、恶病质和肝脂肪变性等多种疾病。因此,文章对白色脂肪棕色化的调控因素、信号通路及其对疾病的影响进行综述,以期为发挥白色脂肪棕色化的优势、减少其对机体的消极作用提供参考。

转录组学及其在动物寄生虫研究中的应用

转录组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律的学科。对活细胞所转录的所有RNA进行分析是研究细胞表型和基因功能的一个重要手段。文章在扼要介绍转录组学特点及相关技术的基础上,对其近年来在动物寄生虫研究中的应用进行了全面综述,分析了动物寄生虫转录组学研究中面临的问题与挑战,并对未来动物寄生虫转录组学研究趋势进行了展望,以期为今后系统研究基因、RNA、蛋白质和其他小分子间的相互作用和相关系统机制提供新思路,为寄生虫疾病的相关研究提供参考。

棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯复配杀蝇蛆的增效作用

为了研究棕色绿僵菌(Metarhizium brunneum)与高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin)复配在蝇蛆防控中的应用,试验测定了高效氯氰菊酯和棕色绿僵菌的相容性,以及单一棕色绿僵菌组、棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯复配制剂组杀蝇蛆毒性试验。结果表明,即使在较高浓度的下,高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌的菌丝生长情况、孢子萌发率和孢子产量等无显著影响;高效氯氰菊酯与棕色绿僵菌联合使用确实可以增加棕色绿僵菌对蝇蛆的致死率,其中孢子浓度为1×10^(8)个/mL、1×10^(7)个/mL对蝇蛆的累计死亡率分别从90.0%、86.7%提高到100%;孢子浓度为1×10^(6)个/mL、1×10^(5)个/mL、1×10^(4)个/mL的累计死亡率分别从86.7%、50%和36.7%提高到93.3%、70%和63.3%。说明棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯相容性良好,可以一起使用。低剂量的高效氯氰菊酯与棕色绿僵菌联用应用可以降低高效氯氰菊酯的使用量并提高生物防治效果。

捻转血矛线虫伊维菌素耐药相关长链非编码RNA及其调控功能分析

为探究捻转血矛线虫伊维菌素耐药分子标记和关键调控元件,通过高质量的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)表达谱对捻转血矛线虫敏感与耐药虫株lncRNA的顺式调控(Cis-regulation,cis)和竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA,ceRNA)调控进行分析,筛选影响虫体伊维菌素耐药机制的微小调控分子。本研究利用RNA-seq技术对捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株进行测序,根据生物学软件预测结果,筛选出位于蛋白编码基因上下游10 kb以内的lncRNA作为顺式调控作用的元件。对差异lncRNA进行GO和KEGG富集分析,并将显著差异的lncRNA和miRNA通过Target finder和Cytoscape v3.7.1软件建立lncRNA-miRNA调控网络和可视化分析。根据miRNA调控元件对lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA调控网络进行连通性分析,结合耐药相关信号通路的富集结果构建lncRNA-miRNA-mRNA可视化网络,同时对随机选取的10个差异lncRNA进行qRT-PCR验证。结果显示:1)捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株中筛选出5374条转录本,共预测到858个新lncRNA中有474个靶向到mRNA,且有205个lncRNA差异表达显著。其中,102个上调、103个下调。预测结果中723个lncRNA通过顺式调控作用靶向到1320个上下游基因,共匹配1566组调控关系。2)GO和KEGG富集结果显示,大量靶基因涉及到催化活性、转运活动、代谢过程、细胞膜以及代谢途径、内吞作用、甘油磷脂代谢、转运等信号通路。3)根据lncRNA-miRNA调控网络分析显示,205个显著差异lncRNA靶向结合371个miRNA,进而组成3227组调控关系且连通性较高。4)qRT-PCR验证结果显示,10个差异表达的lncRNA与RNA-seq结果表达趋势一致。综上,该研究成功获取lncRNA表达谱并构建部分耐药相关通路的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,为进一步探究lncRNA在捻转血矛线虫伊维菌素耐药调节机制中的作用提供理论依据。

布鲁氏菌S2疫苗株间接ELISA检测方法的建立

为了区分布鲁氏菌S2疫苗株和布鲁氏菌野毒株,试验通过比对NCBI上公布的布鲁氏菌S2疫苗株和M28野毒株全基因组序列,筛选出S2疫苗株特有基因GL_0002189,对该基因进行克隆、原核表达及蛋白质纯化,以纯化的重组蛋白作为抗原建立间接ELISA检测方法,对该方法的反应条件进行优化后确定判定点,同时对建立的间接ELISA检测方法进行重复性验证、特异性和敏感性试验,并对部分曾接种过布鲁氏菌S2疫苗的83份牛血清进行检测。结果表明:重组蛋白GL_0002189同时以可溶形式和包涵体形式表达,经纯化得到大小为29.2 ku的重组蛋白;在建立的间接ELISA检测方法中,最适重组蛋白包被浓度为2.5 ng/μL,最适血清稀释度为1∶100,最佳酶标二抗稀释度为1∶5 000,判定点为0.586,该方法的特异性为95.0%,敏感性为93.3%,且具有较好的重复性。利用建立的间接ELISA检测方法对83份牛血清进行检测,检出率为7.2%。说明试验建立的间接ELISA检测方法可区分布鲁氏菌S2疫苗免疫牛血清和布鲁氏菌野毒感染牛血清。