内蒙古地区致奶牛子宫内膜炎葡萄球菌超抗原基因分布及耐药性研究

为了解内蒙古地区致奶牛子宫内膜炎葡萄球菌超抗原基因分布及其耐药情况，采用PCR对分离到的葡萄球菌进行鉴定并检测超抗原基因在分离菌中的分布，应用微量肉汤稀释法开展分离菌的药敏试验和PCR检测β-内酰胺类耐药基因BlaZ和mecA的流行情况。结果表明，共分离到金黄色葡萄球菌28株（52．8％），凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）25株（47．2％）；超抗原基因SEJ在分离菌中的携带率最高（70．0％），超抗原基因SEA、SEB及SEE携带率最低（1．9％），其他超抗原基因携带率在9．4％～43．4％之间；分离到的葡萄球菌对青霉素耐药率最高（96．2％），对万古霉素最敏感，有多重耐药菌株检出；分离菌中BlaZ携带率达98％，金黄色葡萄球菌中未检出mecA，但CNS中mecA携带率为24．5％。内蒙古地区奶牛子宫内膜炎致病葡萄球菌有12种肠毒素及eta、etb、TSST-1检出，其中SEJ基因的携带率最高；葡萄球菌对β-内酰胺类耐药率较高，并且发现了多重耐药菌株的流行。

靶向enJSRV env基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效率的测定

为探讨绵羊内源性反转录病毒(enJSRV)在绵羊胚胎发育过程中的作用,利用脂质体将pEGFP-C1空载体转入绵羊绒毛膜滋养层细胞中,测定其转染效率。同时构建抑制enJSRV env基因的RNA干扰质粒,并将其转染到能稳定表达enJSRV env基因的绵羊绒毛膜滋养层细胞中,通过荧光定量PCR检测其干扰效率。结果显示,重组干扰质粒enJRSV-env-shRNA-1、enJRSV-env-shRNA-2、enJRSV-env-shRNA-3、enJRSV-env-shRNA-4、Negative-shRNA构建成功。Lipofectamine LTX脂质体体积为6.0μL,转染混合物体积为100μL,转染48h组的转染效率最高,为42.37%。与正常对照组细胞的enJSRV-env mRNA表达量相比,转染靶基因干扰质粒的各组绵羊绒毛膜滋养层细胞中enJSRV-env mRNA表达量分别下调了73.56%、66.82%、33.66%和18.16%。筛选出了一个干扰效率最高的RNA干扰质粒enJRSV-env-shR-NA-1,为以后包装慢病毒及进行动物试验来揭示enJSRV的生殖生物学作用奠定了坚实的基础。

四种分子伴侣促进牛支原体膜蛋白在大肠杆菌中可溶性表达研究

为研究分子伴侣是否可以促进牛支原体膜蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达及表达的蛋白是否具有活性,应用原核表达和Western blot方法进行检测,结果表明:1)牛支原体一个膜蛋白M1的截短片段在大肠杆菌表达系统中以包涵体形式表达,改变诱导时间、温度以及诱导剂浓度均未改变其表达形式;2)将4种分子伴侣pGKJE8、pGro7、pG-Tf2和pTf16分别与含有目的蛋白的重组质粒在表达工程菌(BL21)中共表达,当加入终浓度为1.0mmol/L IPTG以及0.5mg/mL L-阿拉伯糖或5.0ng/mL四环素的诱导剂,37℃诱导5h,发现分子伴侣pGTf2和pG-KJE8能显著提高M1截短片段的可溶性表达,其他2种分子伴侣未改变M1的表达形式;3)可溶性表达的M1截短片段与牛支原体阳性血清可以发生特异性反应。因此,研究发现2种分子伴侣可以使牛支原体膜蛋白在大肠杆菌表达系统中以可溶性形式表达,但未改变其生物活性,该研究结果可为建立牛支原体有效的血清学诊断方法及亚单位疫苗的研制奠定基础。

液质联用-同位素内标法测定赛马血液、尿液中茶碱残留

目的建立液质联用-同位素内标法测定赛马血液和尿液中茶碱残留的方法。方法采用6D-茶碱作为内标物,利用强阳离子固相萃取小柱提取茶碱。采用Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,2.7μm),0.1%甲酸水溶液(5 mmol·L^(-1)甲酸铵)-0.1%甲酸乙腈为流动相,梯度洗脱;流速为0.4 mL·min^(-1);电喷雾源(ESI)离子源;正离子模式;茶碱以181.1>124.1,96.0 m/z(内标物187.1>126.9,99.0 m/z)以多反应监测(MRM)扫描方式进行定性定量。结果使用Waters Oasis PRIME MCX 3CC/60 mg固相萃取小柱最优,血清和尿液茶碱浓度在1.00~100.00 ng·mL^(-1),2.50~100.00 ng·mL^(-1)与峰面积线性关系良好(r^(2)分别为0.9999和0.9996),检测限为0.30,0.75 ng·mL^(-1),定量限为1.00,2.50 ng·mL^(-1),相对回收率分别为98.93%~114.49%、94.85%~116.25%,批内精密度≤3.81%,批间精密度≤15.53%,血清基质对茶碱有较强抑制作用,尿液抑制作用较弱。结论经方法学验证,该方法操作简单、快速、准确、灵敏度高,可适用于马兴奋剂中茶碱残留量的检测。