METTL16通过调节消皮素D介导的细胞焦亡抑制胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭能力的实验研究

目的探讨甲基转移酶样蛋白16(METTL16)对胶质母细胞瘤(GBM)细胞增殖和侵袭能力的影响,并揭示其潜在的分子生物学机制。方法体外培养U87及U251人GBM细胞株,通过转染METTL16过表达载体获得过表达METTL16基因的U87及U251细胞株,并将实验细胞分为阴性对照(NC)、过表达阴性对照(OE-NC)及METTL16过表达(OE-METTL16)组;实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质免疫印迹实验(WB)检测METTL16基因过表达情况;CCK-8实验检测过表达METTL16基因对实验细胞株增殖能力的影响;细胞划痕实验及Transwell小室实验检测过表达METTL16对实验细胞株细胞迁移、侵袭能力的影响;流式细胞术检测过表达METTL16对实验细胞株凋亡及细胞周期的影响;WB实验检测过表达METTL16对实验细胞株焦亡标志物蛋白表达水平的影响。结果WB及qPCR实验表明,过表达METTL16基因的实验细胞株构建成功;CCK-8实验显示,与NC、OE-NC组相比,OE-METTL16组实验细胞株的细胞增殖能力均降低(均P<0.05);细胞划痕及Transwell实验表明,在U87、U251实验细胞株中,OE-METTL16组的细胞划痕愈合率及迁移、侵袭细胞数量均低于NC、OE-NC组(均P<0.05);流式细胞术结果显示,与NC、OE-NC组相比,OE-METTL16组实验细胞株细胞凋亡率均增加(均P<0.01)。此外,OE-METTL16组较NC、OE-NC组的G2/M期细胞占比均增加(均P<0.01),过表达METTL16可以诱导实验细胞株的细胞周期在G2/M期停滞。WB实验可见OE-METTL16组实验细胞株中的焦亡相关标志物白细胞介素1β、核因子κB、髓样分化因子88、核苷酸结合寡聚化结构域样受体3、消皮素D(GSDMD)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1的表达水平较NC、OE-NC组均增加(均P<0.05)。结论METTL16可通过调节GSDMD介导的细胞焦亡抑制GBM细胞的增殖、迁移、侵袭;其可作为潜在的靶向分子,为GBM治疗提供新的思路。

沉默神经纤毛蛋白1和血管内皮生长因子基因抑制耐药性多形胶质母细胞瘤干细胞的体外实验研究

目的探讨神经纤毛蛋白1(NRP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)在多形性胶质母细胞瘤(GBM)复发和耐药性中的机制。方法体外培养人源性GBM1A和GBM22细胞株,通过感染慢病毒shRNA的方式沉默VEGF或NRP-1。根据感染慢病毒shRNA的种类,将两种细胞株分别分为shCont组(感染无义序列shRNA)、shNRP-1组(感染NRP-1慢病毒shRNA)及shVEGF组(感染VEGF慢病毒shRNA)。采用实时荧光定量聚合酶联链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法检测肿瘤细胞株在沉默NRP-1或VEGF基因后干细胞标志物[包括:性别决定区Y盒2(Sox2)、表皮生长因子受体(EGFR)、N-钙黏附素(N-cadherin)、CD133、细胞间质上皮转换因子(c-Met)]的基因和蛋白表达情况。采用细胞划痕实验、Transwell小室测定法、神经球形成实验及MTT法检测肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力、神经球形成能力及细胞代谢活性。采用细胞生长抑制实验检测肿瘤细胞株在沉默VEGF或NRP-1后对替莫唑胺(TMZ)、紫杉醇(PTX)和卡博替尼(XL-184)的敏感性。向GBM1A和GBM22细胞株中的shCont组和shNRP-1组分别加入10μg重组VEGF,分为shCont组、shCont+VEGF组、shNRP-1组、shNRP-1+VEGF组,判断NRP-1与VEGF之间的相互作用。结果GBM1A细胞株中,shVEGF组和shNRP-1组Sox2、EGFR、N-cadherin,CD133及c-Met的mRNA含量均较shCont组下降(均P<0.05)。GBM1A细胞株中,shNRP-1组和shVEGF组EGFR、CD133、N-Cadherin的蛋白质相对表达量、24 h和48 h时的细胞划痕愈合率及发生细胞迁移的比例均较shCont组低(均P<0.05),但shNRP-1组和shVEGF组间的差异均无统计学意义(均P>0.05);GBM22细胞株得到相似的结果。在GBM1A细胞株和GBM22细胞株中,3组细胞活力的差异均无统计学意义(均P>0.05)。根据绘制的剂量-生长曲线,GBM1A细胞株中,shNRP-1组和shVEGF组TMZ、PTX、XL-184的半抑制浓度(IC50)均低于shCont组(均P<0.05);在GBM22细胞株得到相似的结果(均P<0.05)。GBM1A细胞株中,shCont组和shCont+VEGF组形成神经球的数量均高于shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组(均P<0.05),其中shCont+VEGF组高于shCont组(P<0.05),而shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组间的差异无统计学意义(P>0.05);GBM22细胞株得到相似的结果。结论沉默VEGF或NRP-1基因在不影响GBM本身活力的情况下可有效抑制其干细胞性,降低其迁移能力及侵袭力,并恢复其对化疗药物的敏感性;VEGF介导的细胞迁移可能依赖NRP-1发挥作用。