小鼠SGK3真核表达载体的构建及鉴定

目的构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶3(serum and glucocorticoid-induced protein kinase 3,SGK3)基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry,并观察和验证其在转染细胞HEK293中的表达。方法通过聚合酶链式反应将实验室保存的真核表达质粒pcDNA3.1-MYC-SGK3中目的基因SGK3与mCherry融合并扩增出来,然后定向克隆至pcDNA3.1-MYC质粒中,经限制性内切酶消化和测序证实后,通过脂质体法转染HEK293细胞,Western blotting法检测目的基因的蛋白表达情况。结果测序结果与之前预期结果相符,证实pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry真核表达载体构建成功。Western blotting结果显示,转染pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry的HEK293细胞出现清晰的阳性反应条带,说明目的片段成功表达。结论pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry真核表达载体构建成功。

小鼠Cdc25B基因的真核表达载体构建及鉴定

目的构建含有小鼠Cdc25B基因的真核表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B,并观察和验证其在真核细胞中的表达。方法目的基因Cdc25B经化学合成后,定向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经过限制性内切酶KpnⅠ和ApaⅠ进行双酶切和测序鉴定,构建真核表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B,应用脂质体法转染HEK293细胞,通过Western blot检测细胞内Cdc25B的表达。结果pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B真核表达载体构建成功,将其转染HEK293细胞48 h,提取细胞蛋白,利用Western blot检测到细胞内Cdc25B的表达,并且测序结果与预期结果一致。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B。

小鼠Cdc14A荧光表达载体的构建及鉴定

目的构建含有小鼠Cdc14A基因的荧光表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry,并观察和验证其在真核细胞中的表达。方法通过聚合酶链式反应将实验室保存的真核表达质粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A中目的基因Cdc14A与mcherry融合并扩增出来,然后定向克隆至pcDNA3.1-MYC-C质粒中,经限制性内切酶消化和测序证实后,通过脂质体法转染HEK293细胞,Western blotting法检测目的基因的蛋白表达情况。结果测序结果和之前预期结果相符,证实pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry荧光表达载体构建成功,Western blotting检测转染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的细胞出现清晰的阳性反应条带,说明目的片段成功表达。结论pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry荧光表达载体构建成功。

Wee1在小鼠1-细胞期受精卵中的表达和定位

目的研究Wee1在小鼠1-细胞期受精卵发育全过程(G_(1)、S、G_(2)、M期)中的表达和定位,为进一步探究Wee1对小鼠胚胎有丝分裂(主要是G_(2)/M转换)的作用提供理论依据。方法应用qRT-PCR和免疫印迹技术分别检测小鼠1-细胞期受精卵在G_(1)、S、G_(2)、M不同时期Wee1的表达谱,并利用间接免疫荧光观察Wee1蛋白在1-细胞期受精卵发育全过程中的定位。结果Wee1 mRNA和蛋白在不同时期的表达水平变化趋势一致:从G_(1)到G_(2)期表达水平持续升高(P<0.05),但进入M期后表达水平显著降低(P<0.01)。间接免疫荧光显示:Wee1蛋白在G_(1)、S期定位于细胞质,在G_(2)期Wee1蛋白开始向核转位,M期细胞核内Wee1蛋白明显增多。结论小鼠1-细胞期受精卵的发育伴随Wee1表达水平的改变和Wee1蛋白的核浆转位,提示Wee1表达水平及其蛋白亚细胞定位的改变可能是调节小鼠1-细胞期受精卵细胞进程的机制之一。

小鼠Cdc25B突变型S15A荧光表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠Cdc25B的突变型Cdc25B(S15A)的荧光表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP,并观察其在真核细胞中的表达以验证载体是否构建成功。方法利用PCR技术从质粒模板上扩增荧光表达的EGFP目的基因,将其与pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)载体连接,利用限制性内切酶XbaⅠ和Bam HⅠ进行双酶切电泳后做测序鉴定,构建pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP荧光表达载体,利用脂质体法使其转染HEK293感受态细胞,通过Western blot法检测细胞内荧光质粒的表达。结果荧光表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP构建成功,将其转染至HEK293感受态细胞,于48 h后提取细胞蛋白,利用Western blot法检测到细胞内荧光表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP成功表达,并且测序结果与预期一致。结论成功构建了荧光表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP。

血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶在恶性肿瘤中的作用

血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶(serum and glucocorticoid-induced protein kinase,SGK)是一种丝氨酸/苏氨酸双特异性蛋白激酶,由3种亚型(SGK1、SGK2及SGK3)组成,3个亚型具有高度同源性,但是功能各不相同。SGK的3种亚型与肿瘤生长、转移、自噬及上皮离子转运的调节有关。SGK与蛋白激酶B(PKB/AKT)有相似的结构、功能和底物特异性,与AKT一样,也是在磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路的下游被激活,该途径由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphate inositol dependent protein kinase 1,PDK1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2(mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2)介导。PI3K可以通过依赖SGK,但不依赖蛋白激酶B(PKB/AKT)的机制在肿瘤的发生中起作用,在许多癌症中SGK表达水平显著增加已得到证实。因此,SGK可能是一个潜在的抗癌治疗靶点。

CDC25b突变载体的构建及其在小鼠受精卵中的表达

目的构建小鼠细胞分裂周期蛋白25b(CDC25b)突变基因的真核表达载体,并观察其在小鼠G2期受精卵细胞中的表达。方法采用PCR法从野生型CDC25b模版上扩增CDC25b(S15A)和CDC25b(S15D)突变基因,定向插入pcDNA3.1(+)-3flag-C空载体中,由限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切电泳后测序验证,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15A)和pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15D)。采用脂质体法将其转染至Stbl3感受态细胞,质粒经在感受态细胞内转化、抽提、酶切及测序鉴定正确后,将重组真核表达质粒用显微注射法注射至小鼠G2期受精卵内,采用Western blot法检测重组质粒突变型CDC25b的表达。结果pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15A)和pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15D)真核表达载体经酶切和测序鉴定,酶切结果显示与目的片段大小一致,测序结果显示突变序列正确;将其注射至小鼠G2期受精卵48 h,可检测到细胞内CDC25b蛋白表达增加(P<0.05)。结论成功构建CDC25b(S15A)和CDC25b(S15D)真核表达载体,验证了突变型CDC25b蛋白表达,可为CDC25b对小鼠受精卵发育调节的研究提供实验基础。