重组产气荚膜梭菌α毒素对家兔的安全性和免疫效力评价

为探究重组产气荚膜梭菌α毒素对家兔的安全性和免疫保护效力,本研究构建了含产气荚膜梭菌α毒素基因的重组质粒pVL1393-CPA,并通过BD BaculoGoldTM转染试剂盒转染Sf9细胞后,经噬斑纯化获得单克隆重组病毒,将其感染High 5细胞进行表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE和western blot检测,结果显示均获得了45 ku的目的蛋白,即为重组α毒素。将重组α毒素用0.1%甲醛溶液灭活脱毒后与ISA 206 VG佐剂乳化制备亚单位疫苗(抗原含量为20μg/mL),以40μg/只肌肉注射体质量1.5 kg~2.0 kg的家兔,同时设PBS对照组,注射后连续观察7 d,结果显示实验兔临床观察无异常,该疫苗对家兔的安全性良好。随后以20μg/只肌肉注射家兔,免疫21 d后以相同剂量加强免疫一次,同时设佐剂对照组和α毒素对照组,首免21 d、二免14 d时采血分离血清,采用ELISA方法检测免疫兔血清IgG抗体效价,同时进行二免血清小鼠体内毒素中和试验以及家兔攻毒免疫保护试验,以评价该疫苗对家兔的免疫保护效力。结果显示,疫苗免疫组家兔血清IgG抗体效价比佐剂对照组和毒素对照组均极显著增高(P<0.001),二免血清对A型产气荚膜梭菌毒素小鼠体内的中和效价为32,疫苗免疫组家兔攻毒后均健活,攻毒保护率达100%,佐剂对照组和毒素对照组家兔攻毒后死亡率则为100%。上述结果表明制备的重组产气荚膜梭菌α毒素疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫保护效力,本研究为开发其他各型梭菌亚单位疫苗提供了重要借鉴。

大肠杆菌性乳腺炎动物模型的建立及临床病理特征研究

为了给预防疫苗和治疗药物的有效性评价提供参考依据,该试验建立了稳定的乳房炎奶牛模型,可为广泛感染性疾病“人病兽防”理念的验证提供可靠途径。自全国不同地区取奶牛临床型乳房炎乳样,经细菌分离鉴定后,将大肠杆菌不同菌株感染6—8周龄Balb/c小鼠和2—6岁泌乳后期健康易感奶牛,通过测定不同菌株对小鼠、奶牛的感染力和致病力,筛选出对两者均具有较强致病性的强毒株;使用强毒株攻击易感奶牛,记录奶牛攻毒前后临床表现,及日产奶量、乳汁细菌数和体细胞数的变化情况;攻击小鼠,记录小鼠攻毒前后临床表现和死亡情况,以建立稳定的大肠杆菌感染致病实验动物模型。结果表明:筛选到3株不同血清型的强毒株大肠杆菌LZ06(O6)、ESH05(O8)、EHL11(O81),能够致死小鼠并导致奶牛乳房炎疾病;建立稳定的大肠杆菌乳房炎模型和小鼠致死性模型。该试验成功筛选到导致奶牛乳房炎的大肠杆菌强毒株,建立的实验动物模型可用于大肠杆菌疫苗和治疗药物的有效性评价,为大肠杆菌引起的人兽共患病“人病兽防”理念和策略提供新的评估途径。

致奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌Csa1A、Hlɑ和EsxA-B重组蛋白的表达及免疫效果的评价

为评价金黄色葡萄球菌(S. aureus)Csa1A、Hlɑ和EsxA-B蛋白的免疫保护作用,本研究构建了重组质粒p GEX-4T-2-Csa1A、pET-22b-Hlα、pGEX-4T-2-EsxA-B并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导并利用相应层析柱纯化后,采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。结果显示,获得了纯度较高的重组蛋白Csa1A(rCsa1A)、Hlɑ(r Hlɑ)和EsxA-B(r EsxA-B),纯度分别为89%、95%、85%,大小分别为54 ku、33 ku和39 ku。以纯化的r Csa1A、rHlɑ和rEsxA-B 60μg/只分别免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔14 d,采用间接ELISA法检测各组小鼠免疫后14 d的抗体效价。结果显示,3种重组蛋白免疫后均能刺激小鼠产生较高效价的抗体,三免后抗体效价分别为1:14 700(rCsa1A)、1:16 890(rHlɑ)、1:15 760(rEsxA-B)。利用5型NM2株(2×10^(7)cfu/只)、8型LZ145株(2×10^(7)cfu/只)、336型XJ44株(2×10^(7)cfu/只)3种血清型S. aureus分别经尾静脉注射攻菌,观察并统计各组小鼠的发病和死亡率,评价各重组蛋白的免疫保护率。结果显示,分别经原核表达了rCsa1A、rHlɑ和rEsxAB。攻菌后对照组小鼠全部死亡;3组重组蛋白免疫组96 h内死亡的小鼠在攻菌48 h后出现精神沉郁,食欲不振等症状,而存活小鼠未出现临床症状。r Csa1A、rHlɑ和rEsxA-B免疫组小鼠提供的抵抗NM2、LZ145、XJ44菌株攻击的保护率分别为60%、60%、50%;80%、70%、70%;50%、60%、60%,其中rHlα的免疫保护效果最佳,其对3种攻毒菌株提供的平均保护率为73.3%,是较为理想的亚单位疫苗候选抗原。以上结果表明,S. aureus rHlα能够刺激免疫小鼠产生抗体,对小鼠提供不同程度的保护力。本研究为奶牛乳腺炎S. aureus亚单位疫苗的研制和应用提供参考依据。

牛呼吸道疾病病原BVDV、IBRV、BPIV3和牛支原体的分离鉴定

2021年12月,内蒙古、山西某肉牛场暴发呼吸道疾病。为了确诊病原,无菌采集发病牛血液、鼻拭子接种于MDBK细胞和Hayflick液体培养基进行病毒和细菌的分离鉴定,同时对分离培养物进行PCR鉴定。将分离毒株负染制样,在透射电镜下观察病毒形态;并对疑似支原体菌落进行吉姆萨染色、Dienes染色,观察菌体形态。根据病毒和细菌分离结果初步鉴定为多种病原混合感染所引起。从PCR检测以及电镜观察、染色结果可以得出,引起这次牛呼吸道疾病综合征的病原为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒型(BPIV3)和牛支原体(Mycoplasma bovis)。

猫杯状病毒抗原检测胶体金试纸条的研制

以浓缩纯化的猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得5株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为1E2、4C3、5F11、6G9和7D2,分别制备腹水后进行纯化。以多克隆抗体为金标抗体,腹水ELISA和中和效价较高的单抗(4C3)作为检测线抗体,羊抗兔二抗为质检抗体,制备检测FCV病毒抗原的免疫胶体金快速诊断试纸条。在pH为7.4的条件下,金标抗体的最适质量浓度为0.1 g/L,检测线最佳包被质量浓度为1.0 g/L,质控线最终质量浓度为0.5 g/L。经检测该试纸条具有敏感性高,特异性强,稳定性好的特点,用制备的胶体金试纸条与RT-PCR方法同时对76份猫鼻咽拭子进行检测,比较两者的符合率,符合率在90%以上。结果表明,本试验研制的胶体金试纸条可以用于FCV的临床检测。

鹦鹉热衣原体亚单位疫苗免疫原性及免疫保护性研究

本研究将鹦鹉热衣原体的MOMP基因经PCR扩增后与pET-22b(+)载体连接构建重组质粒,转化入E.coli,通过IPTG诱导表达MOMP蛋白,鉴定重组蛋白的表达和反应性。结果显示,重组蛋白被成功表达,分子质量大小为40 ku,经溶解、透析纯化后,重组MOMP蛋白纯度为91%,能与鼠抗重组MOMP蛋白抗体产生特异性反应,与鹦鹉热衣原体阳性血清呈强阳性反应。重组MOMP蛋白与ISA201佐剂乳化制成鹦鹉热衣原体亚单位疫苗,免疫绵羊后抗体效价高达1∶4222,用强毒株攻毒后保护率达100%,表明此鹦鹉热衣原体亚单位疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性。

1种布鲁菌抗体检测试纸条快速检测方法的建立

以光滑型布鲁菌脂多糖(smooth lipopolysaccharide,sLPS)抗原为检测抗原,葡萄球菌蛋白A(SPA)为胶体金标记物,制备胶体金免疫层析试纸条,用于检测布鲁菌抗体。通过敏感性和特异性试验检测试纸条性能。结果显示,试纸条最低可检测血清浓度为0.1 IU/mL。试纸条批内和批间可重复性为100%,不与其他非相关疾病感染血清反应。试纸条法与试管凝集试验对牛、羊血清检测的符合率分别为95.4%和97.2%。结果表明,该试纸条在保证检测特异性的基础上,提高了对样品检测的敏感性,具有敏感、特异、简便、快速的特点,更加适合在基层推广使用。

绵羊肺炎支原体鹦鹉热衣原体二联灭活疫苗的免疫效力研究

为了评价本项目组自制的绵羊肺炎支原体鹦鹉热衣原体二联灭活疫苗的免疫效力,取制备的绵羊肺炎支原体SH-01株及鹦鹉热衣原体重组MOMP蛋白抗原等体积混合后与ISA201佐剂乳化制成灭活疫苗(至少含SH-01株2×10^(8)CCU/m L;重组MOMP蛋白0.3 mg/m L),在配种前15 d免疫健康母绵羊,免疫21 d后采血分离血清分别测定抗绵羊肺炎支原体和抗鹦鹉热衣原体的特异抗体效价;免疫45 d后用绵羊肺炎支原体SH-01株和鹦鹉热衣原体CG1株进行攻毒试验。结果显示,免疫后绵羊肺炎支原体血凝抗体效价高达1∶64,鹦鹉热衣原体ELISA抗体效价高达1∶4850;绵羊肺炎支原体和鹦鹉热衣原体强毒株攻毒后保护率均可达到100%,表明此绵羊肺炎支原体鹦鹉热衣原体二联灭活疫苗具有良好的免疫保护效果。