牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性

采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牛乳腺上皮细胞。形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征;染色体分析结果表明,培养的细胞具有正常的染色体数目。通过荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白5和8。该细胞在添加胰岛素、氢化可的松以及羊催乳素的无血清培养液中诱导培养时,用RT-PCR方法检测到了β-酪蛋白基因的转录。这些结果表明,分离培养的细胞是乳腺上皮细胞,这些细胞在诱导培养的条件下能够转录表达β-酪蛋白。

内蒙古白绒山羊的养殖现状调查报告

为了解和分析内蒙古白绒山羊的养殖现状与生产性能,评估近十年来的改良效果及存栏增数与草场承载力之间的平衡,并为制定未来发展对策提供科学依据,笔者于2004年10月—2006年初在内蒙古白绒山羊中心产区鄂尔多斯市、巴彦淖尔市与阿拉善盟进行了内蒙古白绒山羊养殖现状调查。调查结果表明,目前内蒙古中心产区白绒山羊的总存栏数为997.03万只,其中鄂尔多斯市、乌海市存栏数约536.77万只,巴彦淖尔市272.05万只,阿拉善盟188.21万只,总存栏数由1980年的200万只增加约4.99倍,占全区山羊总头数的49.37%,已成为内蒙古畜牧业的支柱(优势)产业。

内蒙古绒山羊CDK2基因的克隆与序列分析

采用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,首次从内蒙古绒山羊睾丸组织中克隆出羊CDK2基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为EF035041)。结果显示:羊CDK2基因的cDNA序列长为1 355 bp,5′端非翻译区为174 bp,3′端非翻译区为266 bp,开放阅读框为894 bp,编码298个氨基酸。与牛CDK2基因cDNA序列同源性为98%,氨基酸序列完全一致;和其他哺乳动物CDK2基因的cDNA序列同源性也达92%以上;氨基酸序列同源性为93%以上。说明CDK2在结构和功能上有很高的保守性。

抗体分离纯化技术的研究进展

制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败。抗体的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化。重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法。对当前的纯化方法进行了一个简要的综述。

牛体细胞核移植技术研究进展

对近年来牛体细胞核移植技术研究的进展作一综述。其中包括:供体细胞种类、传代次数和所处细胞周期的选择;对供体细胞的特殊处理;卵母细胞的采集;传统去核方法的优化、去透明带核移植技术的建立与发展;胚胎重构、激活和体外培养条件的比较与改进等内容。

国产丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系转化能力的小鼠胚胎干细胞的分离

应用于胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)培养的国产药物可以降低ES细胞的实验成本。研究中以浙江海正药业生产的丝裂霉素(mitomycin,国药准字H33020786)处理小鼠胎儿成纤维细胞,用于胚胎干细胞建系。并制备饲养层,将小鼠囊胚种植在该饲养层上。4-6天后,挑选形态良好的内细胞团(inner cell mass)来源的克隆在胰酶中进行消化,将消化下来的细胞团块传至新鲜的饲养层上。之后,每2-3天传代一次。结果表明,经该丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系嵌合能力的胚胎干细胞的分离。

微滴培养技术的新应用

微滴培养技术在卵母细胞培养和胚胎早期发育研究中有广泛的应用。近期研究发现这项技术又有新的应用范围。有科学家发现将该技术应用于胚胎干细胞可以实现高效传代,在精原干细胞培养和精子发生相关过程的研究方面也可取得很好效果,同时,对早期人类胚胎干细胞的分离过程的监控和对精原干细胞生长过程的观察也相对容易。这些研究结果显示,微滴培养技术在这些新领域的研究与常规培养方法相比具有独特的优势。回顾微滴培养技术的主要发展过程,重点探讨微滴培养技术的最新应用及其优点。

哺乳动物睾丸中c-kit基因表达对生精细胞发育的影响

c-kit和SCF信号传递系统的特性已被广泛报道。但是哺乳动物c-kit基因的结构、功能、时空表达和c-kit突变动物模型相关的研究不多。由于研究方法的精度有差别,造成有些结果不清晰,有些结论还存在争议。该文对哺乳动物c-kit受体的结构和功能进行了阐述,并着重介绍了c-kit在模式动物和家畜生精过程中的表达形式及c-kit突变个体的相关研究进展。最终深入探讨了c-kit在生精细胞增殖、分化及受精过程中所起的作用。通过系统性介绍,明确c-kit在生精过程中起到的重要作用,为生精细胞的增殖、分化及迁移等机理的进一步研究提供了参考。

山羊精原干细胞的分离纯化及鉴定

旨在探究1种简便高效分离纯化山羊精原干细胞的方法。采用三步酶消化对4月龄的山羊睾丸进行处理,分离获得单细胞悬液。将细胞依次培养于明胶、大鼠鼠尾胶原和层粘连蛋白涂层的细胞培养皿中,根据各类细胞贴壁能力和贴壁速度不同进行精原干细胞的富集和纯化,并在各步纯化过程中用精原干细胞特异标记分子PLZF和CDH1进行免疫荧光标记染色鉴定,统计精原干细胞所占的比率,并对获得的细胞进行初步培养和鉴定。每克睾丸中分离出1.36×107个细胞。纯化后每克睾丸组织获得8.7×104个细胞,其中精原干细胞纯度达87.0%。将分离纯化后的细胞在体外培养可形成细胞簇,并表达精原干细胞标记分子CDH1和PLZF。结果表明,通过三步酶消化和差异贴壁方法已经建立起山羊精原干细胞的分离纯化技术。用此技术纯化的山羊精原干细胞(SSCs)能在体外培养增殖,形成细胞簇。

微生态制剂对奶牛产奶性能及日粮营养物质消化率的影响

微生态制剂与抗生素相比,具有无残留、安全、不产生耐药性等特点,符合饲料生产安全无公害的发展趋势。目前,有关微生态制剂在奶牛实际生产中应用效果的研究报道较多,且多数研究结果得出,

大蓟对5种癌细胞抑制作用的研究

目的:研究大蓟对癌细胞生长的抑制作用。方法:细胞形态观察、活细胞计数法和克隆形成率法研究大蓟对人白血病细胞K562、肝癌细胞HepG2、宫颈癌细胞Hela、胃癌细胞BGC823、结肠癌细胞HT-29生长的抑制作用。结果:大蓟可使五种癌细胞形态上发生皱缩、变圆、脱壁、裂碎等变化,生长受到明显抑制,抑制率最高可达81.73%。结论:大蓟有确切的抑癌作用。

小蓟水提液对4种癌细胞生长抑制作用的研究

目的:研究小蓟水提液对癌细胞生长的抑制作用。方法:细胞形态观察、活细胞计数法和克隆形成率法研究小蓟水提液对人白血病细胞K562、肝癌细胞HepG2、宫颈癌细胞Hela、胃癌细胞BGC823生长的抑制作用。结果:小蓟水提液可使4种癌细胞形态上发生皱缩、变圆、脱壁、裂碎等变化,生长受到明显抑制,抑制率最高可达86.03%。结论:小蓟有确切的抑癌作用。

用精原干细胞移植技术制作转基因动物的研究前景

在生物科学、生物医学、畜牧业科学和生物反应器的研究中,转基因动物是非常有用的工具.然而,最常用的制作转基因动物的方法,如原核显微注射和核移植效率都非常低.在最近10年中,研究人员利用精原干细胞移植技术发明了一系列新方法.其中的一些方法一旦与遗传修饰方法相结合,就会形成一套制备转基因动物的新方法.本文综述了与转基因动物制作相关的精原干细胞移植研究成果,如精原干细胞移植技术、精原干细胞的冷冻保存方法、精原干细胞移植受体的准备、精原干细胞的长期增殖和传代培养、精原干细胞的遗传修饰及外源基因的遗传特性等,描述了用精原干细胞移植技术制作转基因动物的一整套方法.根据所用供体和受体的不同,将这种新的转基因动物制作方法分为两类:同种移植法和同体移植法.这一研究领域的进展虽然迅速,但是每一种方法仍然有潜在的困难有待于克服.本文对这些新方法的优点和目前存在的问题进行了探讨.

白绒山羊性控胚胎生产及移植应用研究初探

应用X性控冷冻精液对超排供体白绒山羊进行人工授精,生产性控胚胎并进行鲜胚移植。结果发现,①用性控冻精和鲜精输精的供体母羊,平均卵子回收数分别为13.3和12.5枚,其中性控冻精组受精卵比例为29.6%(55/186),极显著低于鲜精组94.0%(281/299)的比例(P<0.01);②性控胚胎和普通胚胎移植受体母羊产羔率分别为42.2%和58.1%,二者差异极显著(P<0.01);③性控胚胎移植受体母羊所产羔羊雌性所占百分数为100%,极显著高于普通胚胎移植(P<0.01)。表明通过白绒山羊X、Y精子分离、人工授精生产性控胚胎,同时结合胚胎移植技术,可以达到按照生产实际中的意愿得到性别控制子代白绒山羊的目的。

昆明白小鼠胚胎干细胞分离与体外培养

为探索昆明白小鼠胚胎干细胞建系方法,将受孕4.5天的昆明白小鼠囊胚用免疫手术法去除滋胚层,然后将内细胞团(ICM)接种于胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,形成的胚胎干细胞样集落用胰蛋白酶-EDTA消化法传代,培养后进行相差显微镜观察及碱性磷酸酶染色。结果饲养层上生长的ICM细胞呈典型的ES样细胞集落,传至第8代碱性磷酸酶染色呈强阳性。实验表明免疫手术法适用于昆明白小鼠ES细胞建系,获得的细胞集落具有ES细胞的主要生物学性状。

牛肌肉生长抑制素基因敲除打靶载体的构建

【目的】构建两套用于牛肌肉生长抑制素(myostation,MSTN)基因敲除的置换型打靶载体。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)以牛耳皮肤组织基因组DNA为模板分别扩增出两套打靶载体的同源短臂和长臂,再分别插入到两套打靶专用基础载体pMCS-PLP和PⅢ中,构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。【结果】经过PCR、T载体连接和DNA测序,证实载体pPLP-MSTN包含2.8 kb同源短臂和4.0 kb同源长臂,载体PⅢ-MSTN包含1.3 kb同源短臂和6.8 kb同源长臂;经过限制性内切酶酶切鉴定,证实两套载体的同源臂分别正确插入到基础载体内。【结论】两套牛MSTN基因敲除打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN构建成功,载体pPLP-MSTN为不含负筛选标记的传统基因敲除打靶载体,载体PⅢ-MSTN为不含负筛选标记的荧光蛋白启动子捕获打靶载体。

大蓟提取液对4种癌细胞生长抑制作用的研究

目的研究大蓟提取液对癌细胞生长的抑制作用。方法细胞形态观察和活细胞计数法研究大蓟提取液对人白血病细胞K562,肝癌细胞HepG2,宫颈癌细胞Hela,胃癌细胞BGC823生长的抑制作用。结果大蓟提取液可使4种癌细胞形态上发生皱缩、变圆、脱壁、碎裂等变化,生长受到明显抑制,抑制率最高可达92.34%。结论大蓟有确切的抑癌作用,并与中医的气血理论、药物归经理论和肝肾同源理论相一致,在体外细胞水平上也有良好体现,对实验室手段研究中医药同样有着重要指导意义。

原核显微注射产生转基因绵羊胚胎

体外采集绵羊卵丘卵母细胞复合体,成熟培养24 h,经过体外受精培养17 h,比较高速离心对胚胎发育的影响;高速离心可以使黑色脂滴甩到一边从而使受精卵原核清晰可见.然后将绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子和真核细胞表达增强绿色荧光蛋白(EnhancedGreen fluorescence protein,EGFP)的载体DNA显微注射于绵羊受精卵雄原核中,并将异构胚在SOF液中发育培养.结果表明:高速离心组囊胚率低于对照组,但是没有显著性差异(P>0.05);显微注射外源基因2天后在激光共聚焦显微镜下可见荧光胚胎;PCR检测5个荧光胚胎均可见特异性条带.在原核显微注射生产转基因胚胎中,绿色荧光蛋白可作为标记基因进行早期胚胎筛选,为提高转基因动物移植效率奠定实验基础.

奶牛性控冻精应用研究

应用奶牛性控冻精进行人工授精,探讨其情期受胎率、母犊率与常规冻精的差别,以及其不同年龄与配母牛、不同输精时间、不同输精部位与情期受胎率之间的关系,为大规模推广应用提供科学依据。结果:1、奶牛性控冻精人工授精的情期受胎率为56.6%(3020/5335),与普通冻精的情期受胎率59.1%(1328/2246)相比差异不显著(P>0.05),奶牛性控冻精的母犊率为93%(1922/2067),极显著高于普通冻精48.8%(63/129)的母犊率(P<0.001);2、应用性控冻精,青年牛的情期受胎率为69.0%(2333/3382),显著高于经产牛49.2%(961/1953)的情期受胎率(P<0.05);与配母牛发情开始后18～24h输精,其情期受胎率为56.8%(2255/3970),显著高于发情开始后8～12h输精46.1%(629/1365)的情期受胎率(P<0.01);单侧子宫角深部输精,情期受胎率为56.6%(2886/5099),显著高于双侧子宫角输精45.3%(107/236)的情期受胎率(P<0.05)。结果表明:1、性控冻精与普通冻精的情期受胎率无差异,可以规模化推广;2、性控冻精输精母牛情期受胎率的高低与母牛的经产与否、输精时间和输精部位有直接相关性。

“两步法”体外培养山羊卵母细胞的超微结构观察

有假说认为,卵母细胞在体外培养过程中,如果延长GV期,可促进卵母细胞进一步成熟,因而提高发育潜能。采用山羊半卵泡和卵母细胞共培养,抑制卵母细胞GVBD发生,从而延长GV期。比较了共培养前后和恢复成熟培养后卵母细胞的超微结构变化,其目的从亚细胞水平寻找卵母细胞进一步成熟的证据。研究发现,常规成熟培养:有卵周隙存在,但不贯通,局部区域卵膜与透明带结合紧密;部分皮质区尚有细胞器存在;微绒毛大部分从透明带中撤出,倒伏于质膜表面,数量较多,形态较为粗大;皮层颗粒质膜下部分单层分布,部分散布于皮质区;线粒体均匀散布于卵质中央区。共培养前:卵母细胞的卵周隙尚未形成,微绒毛没有从透明带中撤出;线粒体等细胞器分布于皮质区,皮层颗粒成簇状分布,皮质区富含细胞器。共培养后:局部形成卵周隙,微绒毛已自透明带中撤出,数量较多,垂直或倒伏于卵膜表面;线粒体以簇状分批开始内移,皮层颗粒已部分单层分布于质膜下,部分皮质区缺乏细胞器。恢复成熟培养后:卵周隙进一步扩大并且贯通,微绒毛数量减少并且绝大多数垂直于卵膜;线粒体在卵质中央区均匀分布,皮层颗粒卵膜下单层分布,大部分皮质区无细胞器存在。利用“两步法”培养得到的卵母细胞与体外常规成熟培养的卵母细胞相比,更有利于皮层颗粒的质膜下单层分布,卵母细胞卵周隙的形成与贯通,微绒毛数量减少和垂直于卵膜表面,无细胞器皮层区的进一步形成。因此,更有利于卵母细胞胞质的进一步成熟。