内蒙古大学牛、羊体外受精技术研究的发展历史及现状

内蒙古大学多年来在牛、羊体外受精技术的研究及应用方面取得了一系列研究成果,在此基础上相关研究领域得到了进一步发展,建成了哺乳动物生殖生物学及生物技术学科群,形成了自身的研究特色和优势.本文回顾、总结了该研究领域的创立过程、发展进程及现状,同时梳理了主要研究成果.

通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的研究

本研究以羔羊卵巢母细胞为材料,把体外受精技术应用到绒山羊育种工作中,观察了羔羊体外受精卵的体外发育及移植产羔的效果,以便探讨通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的技术途径。对406 枚羔羊体外受精卵用M199 + hcG、M199 + LH 和M199 + hcG+ EGF三种培养基进行体外发育培养。结果是,2～4 细胞期胚的发育率平均分别为40-0 % 、43-6 % 和49-6 % ;桑椹胚和囊胚的发育率平均分别为17-5 % 、15-8 % 和18-8 % 。将49 枚F1 代羔羊2～8 细胞期胚移植给31 只受体母羊,结果有11 只妊娠(35-5 % ) 并产羔12 只(F2 代) ;将24 枚F2 代羔羊2～4 细胞期胚移植给15 只受体母羊,结果有2 只妊娠(13-3 % ) 并产F3 代羔羊2 只。

中国转基因家畜最新研究进展

转基因家畜研究始于20世纪80年代,在2010年以后出现爆发式发展,尤其是中国科学家在转基因猪、牛和羊研究中取得了若干突破性进展.分别在提高繁殖力、提高抗病能力、促进肌肉生长、改良肉质与奶质、建立人类疾病模型、构建乳腺生物反应器及提高羊毛或羊绒质量等方面,取得了国际先进水平的研究成果.本文就上述成果进行简要综述,旨在为深入开展转基因家畜研究提供借鉴.

牛病毒性腹泻病毒致病分子机制的研究进展

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)常侵害牛等多种动物,引起一种极为复杂,呈多种临床症状的牛病毒性腹泻-黏膜病,严重危害全球畜牧业的健康发展.BVDV致病机理非常复杂,给该病的防控和净化带来极大的困难.文章从BVDV分子生物学、病毒感染细胞、免疫逃逸、细胞凋亡等方面进行综述,对BVDV与宿主相互作用研究进行了展望,有助于阐明BVDV致病及产生持续性感染的机制.

口蹄疫病毒致病分子机制的研究进展

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的,在世界范围内对偶蹄的家畜和野生动物都具有高度传染性.口蹄疫病毒感染后可诱导细胞凋亡、逃避先天免疫系统、产生免疫抑制,并形成持续感染.本文对口蹄疫病毒感染后的上述进程进行了综述,以更好地了解口蹄疫病毒与宿主相互作用的分子机制,为口蹄疫防控和新型疫苗的研发提供策略.

Let-7的靶基因研究以及与妊娠的相关性

micmRNAs（miRNAs）是长度约为19-24个核苷酸的一类高度保守的能够在转录后水平调控基因表达的内源性的非编码小分子RNA。Let-7家族是发现比较早、研究比较多的miRNAs之一，最早发现let-7在线虫中能调控细胞分化和增殖时序。此后大量的研究表明let-7家族参与动物器官发育调控，并与多种癌症的发生相关。近几年的研究发现，let-7与妊娠有一定相关性。本文主要综述let-7家族在妊娠组织中的研究，初步阐述其调控妊娠的可能机制。

绵羊体外受精卵的体外发育及冷冻保存研究

将体外成熟、体外受精的绵羊卵子,在体外培养至桑椹胚—襄胚期并进行冷冻保存,观察了培养卵的体外发育和冷冻保存效果。从采自屠宰场的绵羊卵巢中抽取卵母细胞,用含有10％FCS(或NSS)、HCG、E_2和Hepes的M199培养24—26小时,再以经Ionophore A23187诱导获能的新鲜精子进行授精。授精后6—8小时移入发育用培养基内进行培养,发育用培养基为含有10％FCS(或NSS)、丙酮酸钠、Hepes的M 199。授精72小时后,FCS组和NSS组的卵裂率分别为36.9％和45.2％,后者显著高于前者。继续培养7—10天后,桑椹胚～囊胚的发育率分别为11.6％和23.4％,两者间差异极显著。将桑椹胚和囊胚冷冻保存于PBS+20％FCS+10％乙二醇冷冻液内,解冻后的胚胎形态正常率分别为82.0％和71.9％。

牛卵母细胞皮层颗粒荧光染色法质成熟鉴定

以皮层颗粒 (CG)单层分布于质膜下做为卵母细胞质成熟的指标 ,利用CG荧光染色法 ,研究了不同类型牛卵母细胞的质成熟情况。结果表明 :(1)采自直径大于 5mm、2～ 5mm和小于 2mm卵泡的卵母细胞 ,成熟培养前的质成熟率分别为 4 2 %、1 8%和 0 ,三者间无显著差异。但所有的大卵泡卵以及 95 2 %的中卵泡卵 ,CG已分布于皮层 ,而小卵泡卵中则有 51 7%的卵子 ,CG尚未迁移至皮质区 ,仍以簇的形式分布于细胞质的中间。经 2 4h成熟培养后 ,三类卵子的质成熟率分别达到 54 5%、2 8 6 %、和 7 1% ,三者间存在显著差异 (P <0 0 5)。小卵泡卵内的CG趋向于聚集成更大的簇 ,并向皮质区迁移。 (2 )根据卵丘细胞情况而分的四类卵母细胞 :A(带有 5层以上致密卵丘细胞 )、B(带有 3～ 5层致密卵丘细胞 )、C(裸卵或半裸卵 )和D(卵丘细胞已扩散成蜘蛛网状 ) ,成熟培养前的质成熟率分别为 4 3%、0、0和 2 8 0 % ,第四者显著高于前三者 (P <0 0 1)。成熟培养后 ,A、B类卵子的质成熟率 (2 3 1%和 10 8% )显著低于D类卵子 (88 2 % ) (P <0 0 1)。裸卵表现为完全缺乏CG或形态异常。 (3)采卵结果表明 ,大、中、小卵泡卵中 ,A类卵子所占的比例依次减少 (97 7%、56 3%和 18 4 % ) ,B类卵子依次增多 (2 3%、36 6 %和 52 0 % )。

牛冷冻试管胚胎性别鉴定的应用

利用双引物PCR技术对优质良种牛体外受精的冷冻胚胎进行性别鉴定 ,并对分割后的半胚分别进行PCR扩增和染色体分析 ,两种方法的判定结果相吻合。在本实验条件下 ,利用减少PCR体系中细胞的数量来确立最低的模板DNA的检出量 ,2 细胞不能检测 ,4 细胞检出率为 6 2 .5 % ,8 细胞为 90 % ,1 6 细胞以上为 1 0 0 %。对 2 3枚经过性别鉴定后的胚胎进行移植 ,获得 5头纯种试管牛 ,产犊率为 2 1 7% ,与正常的胚胎移植结果 2 7 3% ( 3 1 1 )无显著差异 ,预测性比为 1 0 0 %符合。

小鼠分离胚的培养和移植

将小鼠2—4细胞胚分离成为1/2半胚或2/4半胚后,在体外条件下进行培养,选择发育为桑椹胚、囊胚期的胚胎移植给假孕雌鼠。结果是,分离胚的囊胚发育率在Whitten和BMOC-Ⅲ中分别为88.1％和81.6％,1/2半胚和2/4半胚的发育率分别为89.0％和94.6％(p<0.05),F_1代和ICR1/2半胚的发育率分别为91.7％和49.2％(p<0.01)。在移植1/2半胚和2/4半胚的雌鼠中分别有3只和1只妊娠并产仔鼠2只和1只;在以1/2半胚,去透明带的整胚和保留透明带的整胚为对照移植的三个处理组中其雌鼠的妊娠率和产仔率分别为8.3％和2.8％,30.0％和10.8％,60.0％和36.7％,各处理组间均有显著差异(p<0.01)。

不同培养基对牛体外受精胚发育率及抗冻性的影响

采用M199、SOFaa(aa:Amino Acid)和SOF对牛体外受精卵进行发育培养,比较了三种培养条件下的囊胚发育率、孵化率以及这三种条件下培养出来的囊胚的抗冻能力。在M199和SOFaa处理组,囊胚发育率分别为22.6％和29.0％,孵化率分别为 11.3％和8.1％,两者间无显著差异,但均极显著高于SOF处理组(13.6％,0,P<0.01)。三个处理组的囊胚经冷冻解冻后的存活率分别为78.5％、46.4％和17.3％,孵化率分别为41.9％、23.2％和0,三者间存在极显著差异(P < 0.01)。结果表明,不同的培养液不但影响胚胎发育率,同时也影响胚胎的抗冻能力,M199的培养效果优于SOF,氨基酸能明显提高胚胎发育率及抗冻能力。

牛体外受精胚抗冻性原因初探

采用M 199、SOFaa(aa :aminoacids)和SOF对牛体外受精卵进行发育培养 ,比较了这 3种条件下培养出来的囊胚冷冻存活率 ,并采用脂肪颗粒染色法初步分析了影响胚胎抗冻性的原因。 3个处理组的冷冻存活率分别为78.5 %、46 .4%和 17.3%,三者间存在极显著差异 (P <0 .0 1)。孵化率分别为 41.9%、2 3.2 %和 0 ,三者间存在显著差异 (P <0 .0 5 )。 7枚经M199培养的囊胚均呈现均匀的小脂肪颗粒 (直径 2 .5 μm左右 ) ,SOFaa培养的 11枚胚胎中有 1枚呈不均匀的大脂肪颗粒 (直径 6 .3μm左右 ) ,其它 10枚呈均匀的小脂肪颗粒 ,而SOF组则有 84.6 %(11/13)的胚胎呈大脂肪颗粒。由此可见 ,3个处理组的胚胎冷冻存活率与小脂滴胚比率相一致。这一结果表明 ,脂滴大小与胚胎抗冻能力具有一定的相关性 ,小脂滴胚较大脂滴胚具有更强的抗冻能力 ;发育培养过程中使用不同的培养液以及氨基酸的添加能影响胚胎内脂滴的大小 ,从而影响胚胎的抗冻能力。

DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对AID基因修饰的牛胎儿成纤维细胞的作用

以转AID基因细胞和AID基因敲减细胞为研究对象,旨在探讨5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对其细胞形态、细胞周期、相关基因表达及其基因启动子区甲基化状态变化的影响。此外,还分析了整体基因组去甲基化和位点特异性去甲基化之间存在的差别,探讨提高体细胞重编程效率的方法及其作用机制。通过Real-time PCR、BSP(Bisulfite Sequencing PCR)、Western blotting和流式细胞术等技术分析了5-Aza-CdR对转AID基因细胞和AID基因敲减细胞的影响。结果表明,5-Aza-CdR对转AID基因细胞的影响存在明显的剂量效应,浓度为4μmol/L时,具有明显的细胞毒性,大量细胞死亡(P<0.05)。当使用处理浓度为1-3μmol/L时,细胞形态发生改变,细胞增殖被抑制。核型分析显示,3μmol/L浓度组处理就可以导致转AID基因细胞出现异常核型。使用1μmol/L浓度处理细胞,明显增加了表达报告基因细胞的数量,细胞AID和SOX2的表达量都有所提高,并且SOX2基因启动子区的DNA甲基化水平也有所下降。5-Aza-CdR处理AID基因敲减细胞后,OCT4和SOX2的表达量较对照组明显升高,而NANOG却没有发生变化。结果显示,5-Aza-CdR处理转AID基因细胞可改变细胞形态、细胞周期和报告基因的表达,5-Aza-CdR处理后基因组整体去甲基化和AID基因的位点特异性去甲基化协同作用于体细胞重编程。

雌牛生殖道内游离氨基酸种类及含量分析

根据黄体的大小和形态 ,判断屠宰母牛的发情时期 ,分别收集发情第 3天 (D3)和第 7天 (D7)的输卵管液 (OF)和子宫液 (UF) ,通过HPLC分析游离氨基酸种类及含量。总共检测到 2 3种氨基酸 ,包括除Cys外的 19种必需和非必需氨基酸 ,以及另外四种 (βAla、Tau、Orn和Cit)非蛋白质氨基酸。OFD3、UFD3、OFD7和UFD7的游离氨基酸总量分别为 31 6、 46 9、 2 6 3和 17 2mmol/L ,其中 ,Gly含量最高 ,分别为14 7、14 4、11 1和 4 4,其次为Glu、Gln和Ala ,其他氨基酸的含量均接近或低于 1mmol/L。结果表明 :氨基酸总量及个别氨基酸含量在不同体液及不同发育时期均存在一定程度的差异 [动物学报 49(1) :80～ 85 ,2 0 0 3]。

牛早期胚胎发育中AID基因的表达及其调节区DNA甲基化的动态变化

以具有DNA主动去甲基化作用的活化诱导胞苷脱氨酶(Activation-induced cytidine deaminase,AID,亦称为AICDA)基因为研究对象,检测其在牛卵母细胞及体外受精胚胎发育不同阶段的表达变化及其调节方式,揭示细胞重编程分子机制。应用Real-time PCR、BSP(Bisulfite Sequencing PCR)和免疫荧光化学等方法分析DNA甲基化对牛早期胚胎发育中AID基因表达的影响。结果显示,AID基因在牛早期胚胎发育中受DNA甲基化的调控,AID基因的T-DMR(tissue-dependent and differentially methylated region)位于其转录起始位点-88 bp--431 bp。在牛卵母细胞成熟过程中,T-DMR第2和第3号Cp G位点的DNA甲基化明显去除,而其他位点都未发生变化。卵母细胞在成熟过程中AID基因的积累与DNA甲基化状态变化相关。在牛体外受精胚发育早期的各阶段,尽管AID基因的表达不同,但AID基因T-DMR除第2和第3号CpG位点一直都维持去甲基化状态外,其他位点始终维持甲基化状态。推测其表达的变化可能是胚胎基因组激活有关。以上研究表明,AID基因T-DMR的低甲基化与其表达存在一定的相关性。通过免疫荧光检测发现,从卵母细胞成熟期到桑椹胚期,AID蛋白都是均匀分布于细胞核和细胞质中。而囊胚时期大量AID蛋白集中于内细胞团,这可能对于内细胞团多能性的维持起重要作用。综上所述,牛卵母细胞成熟中积累的AID作用于受精过程,其启动子区的DNA去甲基化与AID基因的表达有关,胚胎基因组激活后AID基因的表达可能与胚胎发育有关。

MAPK和p90^(rsk)在大鼠卵泡发育中的表达与活性

利用免疫组织化学方法研究丝裂原激活蛋白激酶 (mitogen activatedproteinkinases,MAPK)及其底物之一p90 rsk在大鼠卵泡发育过程中的表达与活性。结果表明 ,非活性形式的MAPK存在于大鼠各生长期卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中 ,但磷酸化活性形式的MAPK只存在于部分具有分裂增殖活性的颗粒细胞中。MAPK的作用底物p90 rsk只在各期卵泡的卵母细胞中表达 ,在颗粒细胞中无着色 ,说明MAPK信号级联在卵母细胞和颗粒细胞中具有不同的作用方式。另外 ,胎鼠卵巢的免疫组化染色结果显示 ,MAPK在卵原细胞增殖过程中具有活性 ,表明MAPK信号级联在这一过程中起作用。

microRNA-483和microRNA-486在克隆和转fat-1基因牛组织中的表达

利用荧光定量PCR比较正常受精牛、克隆牛和转基因牛的心、肝、脾、肺、肾、胎盘、子叶、子宫内膜中miR-483和miR-486的表达水平。结果显示,miR-483和miR-486在正常受精牛、克隆牛和转fat-1基因牛的组织中均有表达,其中在心脏中表达量显著高于其他组织。而转fat-1基因牛心脏中miR-483和miR-486表达量均低于正常牛。miR-483和miR-486在不同组织中表达量存在一定差异,在心脏中呈现高表达,提示miR-483和miR-486表达降低可能与心肌肥大、心肌梗死等病理生理过程有关。

大小鼠异种间嵌合胚的培养和移植

本研究观察了大小鼠异种间嵌合胚在体外 培养条件下以及移植后的发育情况。采用聚合法使Wistar-Imamichi大鼠和ICR小鼠的早期胚胎聚合为一体,然后用于体外培养,并进行移植。实验结果表明,大小鼠异种间嵌合胚在含20％FCS的Whitten溶液中有80.8％的胚可发育为囊胚期胚胎。这种胚胎在受体大鼠和小鼠,均能着床,着床率分别为51.3％和53.7％,没有显著差异。着床后的胚胎能够维持到妊娠第10天左右,但以后很快退化、死亡,其原因有待进一步探索。

碳水化合物对牛体外受精胚胎体外发育的影响

目的 在SOF +PVA(合成输卵管液 +聚乙烯醇 )这一化学成分明确培养系统条件下 ,观察了葡萄糖、丙酮酸和乳酸三种碳水化合物对牛体外受精胚胎体外发育的影响 ,以便为今后进一步探讨影响牛早期胚胎体外发育的因素提供实验依据。方法 牛卵母细胞体外成熟和体外受精后 ,在化学成分明确培养系统内进行体外发育培养。结果 实验 1将牛体外受精卵培养于不含有葡萄糖的SOF +PVA培养系统中 ,培养 12 0h后分别移入含有 0、1 5 0、3 30、5 0 0mmol L的SOF +PVA培养系统中 ,对照组胚胎一直在含有 1 5 0mmol L葡萄糖的SOF +PVA中培养 ,结果囊胚的发育率分别为 9 2 % a、12 1%、19 2 % b、18 9%和 11 7% (a <b ,P <0 0 5 )。实验 2将牛体外受精卵分别培养于含有 0、0 10、0 2 4、0 33和 0 6 6mmol L丙酮酸钠的SOF +PVA培养系统中 ,结果囊胚的发育率分别为 9 8%、15 7%、11 3 %、12 9%和 11 9%。实验 3将牛体外受精卵分别培养于含有 0、1 98、3 30、4 79和 5 87mmol L乳酸钠的SOF +PVA培养系统中 ,结果囊胚的发育率分别为 2 0 6 %、2 3 2 %、18 4%、2 1 6 %和 19 3%。结论 在该培养系统条件下 ,培养 12 0h后再加入葡萄糖与培养系统内一直添加有葡萄糖相比更有利于胚胎的发育 ;培养系统中单独缺乏丙酮酸或?

Fat1转基因牛奶对小鼠健康和生殖能力的影响

目的通过饲喂试验,分析fat1转基因牛奶对小鼠行为、健康和生殖能力等的影响。方法取4周龄的B6D2F1/Vr小鼠36只,随机分成6组,每组6只,雌雄各半。分别在饲料中添加fat1转基因牛奶、克隆牛奶和普通牛奶,对上述3组鼠进行饲喂。定期对饲喂小鼠进行称质量,并统计摄食量;在饲喂14周后,每组小鼠均1∶1合笼;生育3次后,记录各组产仔量。同时,对每组小鼠进行血常规和血清生化指标分析。在整个试验期间,定期观察3组小鼠行为,并测量体质量。最后,处死小鼠,分别取各个器官进行称质量。结果与饲喂普通牛奶组相比,饲喂转基因牛奶组和克隆牛奶组的小鼠在体质量、行为、繁殖能力和大部分重要的血液生理生化指标、组织器官的质量等方面均没有显著差异。结论 fat1转基因牛奶对小鼠的健康和生殖能力没有明显不利的影响,表明fat1转基因牛奶对于动物的饮食是安全的。