内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌的分离与鉴定

对内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌进行分离并鉴定。以蒙古族传统发酵乳为材料,采用传统的细菌纯培养分离方法分离乳酸菌株,通过形态学特征及生理生化试验初步确定乳酸菌的基础上,进一步利用细菌16S r DNA基因序列分析和系统发育进化树构建,对其种属进行分析鉴定。分析鉴定结果显示,分离得到的29株乳酸菌共鉴定为2个属,6个种。2个属分别为乳酸杆菌属(Lactobacillus)和肠球菌属(Entercoccus),6个种分别为短乳杆菌(Levilaccillus brevis,4株)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum,8株)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis,9株)、鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum,3株)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii,1株)、耐久肠球菌(Enterococcus durans,4株)。该研究采集的发酵乳样品中乳酸菌资源丰富,代表着内蒙古蒙古族传统发酵乳制品中优势性乳酸菌菌种,为优良发酵剂的研发奠定了微生物资源基础。

牛乳中致病性金黄色葡萄球菌快速检测胶体金免疫层析方法研究

为建立快速检测牛乳中致病性金黄色葡萄球菌(S.aureus)的胶体金免疫层析方法,本研究将鼠抗S.aureus IgG进行胶体金标记,并喷涂于玻璃纤维上制备金标垫,分别以兔抗S.aureus nEBPS重组蛋白IgG和羊抗鼠IgG作为检测线和质控线,组装制备快速检测牛乳中致病性S.aureus胶体金免疫层析试纸条。结果表明:试纸条对致病性S.aureus具有高度特异性,与沙门氏菌、大肠杆菌、布氏杆菌无交叉反应;试纸条最低检出1.0×105cfu/mL的S.aureus。试纸条批内及批间检测试验均具有良好的重复性。试纸条与S.aureus分离鉴定法符合率为90.0%、与PCR试剂盒符合率为83.3%。表明本研究建立的牛乳中致病性S.aureus免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单、快捷等特点,适合于牛乳中致病性S.aureus的现场快速检测。

内蒙古地区牛乳腺炎致病性粪肠球菌表面蛋白esp基因的克隆、表达及抗原性分析

目的 克隆、表达内蒙古地区奶牛乳腺炎临床分离粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的表面蛋白esp基因,对表达产物进行抗原性鉴定及生物信息学分析。方法 以Genbank公布的序列号为CP045045.1粪肠球菌esp基因DNA为模板设计1对引物,对esp基因进行克隆、测序,构建重组表达载体pET-30a(+)-esp后进行原核表达,对表达蛋白进行Western blot鉴定。利用DNA Star生物信息软件对表达蛋白的空间构象,理化特性,跨膜区,抗原性等进行预测分析。结果 测序显示,克隆的esp基因序列长度为776 bp,与NCBI公布的esp序列(CP045045.1)相似度为100%。经PCR及酶切鉴定,重组表达质粒pET30a(+)-esp构建正确。将其转化至原核表达工程菌BL21后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示该蛋白的相对分子质量约28×10^(3)。Western blot分析显示,纯化的重组蛋白能够被相应小鼠抗血清识别。DNAStar生物信息学软件分析显示,该蛋白相对分子质量为37×10^(3),等电点为4.33,带负电荷残基总数54个,带正电荷残基总数30个,分子式为C_(1190)H_(1899)N_(309)O_(438),α螺旋占6.98%,β折叠占1.94%,无规则折叠占68.6%;其二级结构以无规则卷曲为主,表面存在较多抗原表位;6-25位氨基酸之间存在跨膜区域,推测该蛋白具有跨膜特性。抗原性分析显示,esp基因编码蛋白在14-55、59-170、186-197、206-255位氨基酸残基区段存在良好的抗原可及性,以59-170位区间抗原可及性较为集中。结论 内蒙古地区分离的牛乳腺炎致病性粪肠球菌esp基因编码蛋白具有良好的抗原性,可作为该菌感染检测靶标候选抗原。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、BP、AP2三基因的串联表达及其免疫原性研究

为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重叠延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,表达蛋白经亲和层析纯化后进行western blot鉴定和小鼠免疫实验。结果表明,AP1-AP2-BP融合抗原具有良好的反应原性和免疫原性。本研究为进一步研究无乳链球菌基于AP1-BP-AP2融合蛋白的致病机制、检测制剂及亚单位疫苗研制提供了实验依据。

科尔沁奶牛防御素基因BNBD5原核表达产物的生物活性研究

目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,并通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌验证抑菌生物活性。结果:成功构建了pET-30a-BNBD5重组载体,经IPTG诱导,pET-30aBNBD5融合表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的多肽分子质量大小相符,证实已得到重组表达产物,通过抑菌试验可知其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌性。结论:获得科尔沁牛防御素BNBD5基因体外表达产物,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。

内蒙古地区乳源性金黄色葡萄球菌的分离与分子鉴定

目的对从内蒙古通辽市地区患乳腺炎奶牛乳中分离到的1株疑似金黄色葡萄球菌进行分子鉴定,并建立一种能直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR方法。方法采集疑似金黄色葡萄球菌感染乳腺炎奶牛乳液标本,进行细菌的分离培养,革兰染色、镜检、生化特征鉴定,溶血及药敏试验,并进行16SrDNA序列扩增、测序分析、分子鉴定,采取扩增序列NCBI Blast比对方法建立进化树进行分子进化分析。结果该分离株菌为革兰染色阳性,菌落形态、菌体形态、培养特性与分子特征均与金黄色葡萄球菌相符。PCR扩增出金黄色葡萄球菌16SrDNA序列,长度为611bp,该序列与GenBank公布的葡萄球菌(KY784112.1)16SrDNA序列相似性为100%,进化树分析该分离株与KY784112.1金黄色葡萄球菌属于近缘发育分枝。结论分离菌株为乳源性金黄色葡萄球菌,采用PCR法可作出快速检测。

内蒙古中东部地区乳源性大肠埃希菌PCR检测及其耐药性分析

目的分离牛乳源性大肠埃希菌(E.coli)并进行PCR检测及耐药性分析。方法根据GenBank上公布的牛源致病性大肠埃希菌基因序列,利用Primer5.0和DNAMAN生物信息学软件,根据该致病菌基因组序列16S～23SrRNA间隔区保守序列设计并合成1对引物,对牛乳中分离的大肠埃希菌进行基因扩增和序列测定,同时利用琼脂平板扩散方法分析阳性菌株的耐药状况。结果大肠埃希菌基因PCR扩增产物为396bp,与预期片段大小相符;测序结果与GenBank上公布的牛源大肠埃希菌(X80731.1)基因序列相似性为97.22%,与标准菌株大肠埃希菌(CVCC247)基因序列相似性为100%。分离菌株普遍对卡那霉素、氧氟沙星、氟哌酸高度敏感,对四环素、氨苄青霉素高度耐药。结论成功分离出牛乳源大肠埃希菌菌株,该组分离菌对四环素和氨苄青霉素高度耐药,为进一步建立牛乳中致病性大肠埃希菌的分子检测方法及指导临床用药提供了依据。

内蒙古东部区牛乳中金黄色葡萄球菌和无乳链球菌耐药性分析

目的掌握内蒙古自治区东部区通辽市主要产奶地区的牛乳中致病性金黄色葡萄球菌和无乳链球菌流行情况及其对常用抗生素药物的敏感性,为奶牛乳房炎的治疗提供参考依据。方法从通辽市周边奶牛场采集患乳腺炎的奶牛乳样19份,进行细菌培养和分离鉴定,对分离出的金黄色葡萄球菌和无乳链球菌菌株进行药物敏感性试验。结果19份奶样中共分离出24株金黄色葡萄球菌和22株无乳链球菌。药敏试验显示,分离的24株金黄色葡萄球菌菌株对氯霉素、氨苄青霉素的耐药率分别为95.8%和54.2%,而对链霉素等大多数抗生素均表现高度敏感或中度敏感;分离的22株链球菌对链霉素等7种抗生素的耐药率在50.0%～95.5%之间。结论内蒙古通辽市周边地区牛乳中分离的金黄色葡萄球菌对氯霉素、氨苄青霉素表现较高耐药性,分离的无乳链球菌对链霉素等抗生素普遍耐药,可能与抗生素滥用有关。

以乙型肝炎核心病毒蛋白为载体融合金黄色葡萄球菌IsdA表位多肽的免疫原性

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S aureus）,是一种最常见的条件致病菌。可以引起人和动物的多种类疾病,感染牛导致的牛乳房炎给奶牛产业造成巨大损失;感染人可引起皮肤和软组织感染,严重者可出现肺炎、菌血症、脓毒血症、心内膜炎及骨髓炎。S aureus中存在大量的耐药株,尤其是耐甲氧西林S aureus,降低了抗生素疗法的可靠性。疫苗可以通过主动免疫或被动免疫途径切断感染辅助抗生素疗法,但至今还没有商品化的S aureus疫苗上市，研发竞赛已在全世界范围展开。

禽流感病毒A/duck/Fujian/31/2007(H5N1)株M1基质蛋白的原核表达与免疫原性鉴定

经生物学软件DNAStar分析,参照已发表的禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)(H5N1)基因组序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约750bp的M1基因片段,将目的片段定向克隆至pET30a表达载体,经酶切及测序鉴定正确后转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,BCA法测定纯化蛋白的浓度为0.656mg/mL,免疫印迹检测结果表明,纯化的重组蛋白具有良好的反应活性。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测结果表明,重组蛋白可产生抗M1蛋白特异性抗体,具有良好的免疫原性。本研究成功表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,且重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研制H5N1亚型流感病毒诊断试剂及基因工程疫苗奠定基础。

奶牛乳腺炎无乳链球菌菌体蛋白抗原研究进展

奶牛乳腺炎是影响奶牛产奶的重要疾病之一,其病因复杂,但主要以无乳链球菌等致病菌感染所致.无乳链球菌不仅引起奶牛乳腺炎,同时也是重要的人畜共患性致病菌,因此具有重要的公共卫生意义.对于奶牛乳腺炎的防治技术研究一直未能够获得有效突破,常规疫苗经临床使用效果不佳,因此探索其新型有效抗原靶位抗原成为目前研究的"热点".根据国内外研究报道,无乳链球菌具有多种重要的菌体蛋白,表现出良好的抗原性,可作为研究新型疫苗的候选抗原蛋白.本文重点概述其5种菌体蛋白,即菌毛岛屿PI、表面免疫相关蛋白sip、磷酸甘油激酶Pgk、纤维蛋白原结合蛋白Fbs A/B、黏附蛋白Bi BA的研究进展,为相关研究人员提供具有价值的研究信息.

乳源致病性金黄葡萄球菌原生质体膜表面蛋白nEBPS的亚细胞定位研究

目的克隆牛乳源致病性金黄葡萄球菌nEBPS基因,经工程菌表达得到其编码抗原纯化蛋白,制备多克隆抗体,采用间接荧光抗体法鉴定nEBPS蛋白。方法设计1对克隆引物,PCR扩增牛乳腺炎金黄葡萄球菌内蒙古分离株EBPS基因序列,构建重组表达质粒,转化工程菌,表达膜表面亚单位蛋白nEBPS,纯化后免疫家兔制备抗nEBPS蛋白抗体,采用间接荧光抗体法对乳源致病性金黄葡萄球菌原生质体膜表面蛋白nEBPS进行亚细胞定位。结果在含25μg/ml Amp、0.015g/ml NaCl的LB液体培养基中成功培养制备了金黄葡萄球菌原生质体。对原生质体细胞(表面)和利用0.02g/ml NaCl高渗溶液裂解原生质体细胞离心获得的细胞膜残片进行间接荧光抗体试验,均出现特异荧光。结论间接荧光抗体试验鉴定nEBPS蛋白为膜表面蛋白,可作为乳及乳制品金黄葡萄球菌检测和制备免疫制剂的靶抗原。

蒙古绵羊输卵管组织中β-防御素表达的原位杂交技术检测

β-防御素(β-defensin)是一类大量存在于哺乳动物上皮组织内的内源性抗微生物肽,它们在非特异性免疫反应中占重要地位。为阐明蒙古绵羊β-防御素(Sheep beta-defensin,sBD-1)在输卵管组织内的表达定位,以扩增的sBD-1 cDNA作为探针,并采用核酸原位杂交技术进行检测。结果表明:sBD-1 mRNA在蒙古绵羊输卵管黏膜层上皮细胞游离面的胞质内表达,固有层、肌层、结缔组织中无表达,符合β-防御素主要表达于黏膜表面细胞的一般规律。

一株裂解多重耐药性无乳链球菌噬菌体的分离及生物特性分析

噬菌体是一类能够感染细菌的病毒。利用噬菌体控制细菌感染的噬菌体疗法,具有特异性强、自我增殖快、抗菌能力强和研发时间短等优点,特别是对多重耐药菌感染的治疗具有广阔的发展前景。本试验利用乳腺炎临床分离的多重耐药无乳链球菌作为宿主,从牛生存环境中的污水样、粪水样中分离特异性裂解噬菌体,并对其生长特性进行分析研究。结果表明,该试验已成功分离出1株多重耐药性粪肠球菌裂解性噬菌体,噬菌斑清晰,潜伏期短,增长速度快。临床分离到的多重耐药性无乳链球菌有着较好的抑菌效果,对自然环境下温度、酸碱度的耐受性较强,为多重耐药菌的治疗提供了理论依据和技术支撑。

牛结核分枝杆菌早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83基因的串联表达及其抗原性鉴定

为获得一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌(MB)感染早期标识物MPB70、MPB83分泌性蛋白的串联抗原蛋白,本研究利用DNAStar生物信息软件对MB感染早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83抗原结构区域进行预测后设计合成相应引物,并在两个片段之间引入16位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术获得MBP70与MBP83基因的抗原优势区核苷酸串联片段,将其连接至原核表达载体pGEX-6p-1中经诱导、表达,结果显示构建的重组表达载体获得高效表达,目的抗原蛋白的分子质量约58ku,纯化后重组蛋白的纯度>90%,经免疫BALB/c小鼠4次后,抗体效价达到1∶51200。本实验获得了具有明显抗原活性的MB感染早期分泌性蛋白串联抗原MPB70+MPB83,为后续进一步研发MB早期感染标识物快速检测试剂盒奠定了基础。

金黄色葡萄球菌溶血素研究进展

自21世纪以来,金黄色葡萄球菌迅速成为国内外人畜受感染的重要致病菌,造成严重的感染与发病.随着人畜抗生素的滥用,多重耐药菌,甚至"超级细菌"产生的报道逐年增多,使得金黄色葡萄球菌成为重要的公共卫生安全问题而备受重视.因此,国内外学者为了能够有效预防金黄色葡萄球菌的危害,近年来针对金黄色葡萄球菌的致病因子进行了一系列的研究,尤其对其溶血素的研究报道较多,并获得了一些进展.本文主要对近年来国内外金黄色葡萄球菌溶血素研究状况作一综述和展望.

人畜结核分枝杆菌快速检测技术研究进展

牛结核分枝杆菌病是一种人畜共患疫病,由牛分枝杆菌所引起.牛感染分枝杆菌后不仅引起乳房炎、结核性胸膜炎等疫病,而且还残留于牛乳中影响牛奶品质和产奶量,给奶业和公共安全带来极大危害.由于牛结核分枝杆菌病是一种慢性消耗性疫病,根据我国农业农村部对牛结核病的防控办法,通过快速、精准检出及淘汰处置是防控此疫病发生发展的关键措施.本文主要综述牛结核分枝杆菌检测技术研究进展,并对其优点及不足进行评价,为相关研究人员研发新型快速、便捷、精准的检测技术产品提供理论依据.

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿亚基不同组合融合抗原对BALB/c小鼠免疫保护性实验

为评价牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿亚基不同组合融合蛋白AP1-AP2、 AP1-BP、 BP-AP2、AP1-BP-AP2对BALB/c小鼠的免疫保护性,本研究取各融合蛋白与同体积的弗氏佐剂进行乳化,分别制备融合抗原免疫制剂,4种免疫制剂均以50μg/只对小鼠进行4次免疫后均产生了较高滴度的抗体,其中AP1-BP-AP2融合抗原产生的抗体滴度水平最高,可达1∶25 600。在免疫后第50 d时利用104 cfu/mL乳腺炎无乳链球菌攻毒,每天观察记录小鼠的精神状态、食量变化等生理状态。攻毒试验结果显示,4种不同融合抗原均显示不同程度的免疫保护性,其中AP1-BP-AP2融合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护性为最佳,其免疫保护指数PI达到80%。本研究首次创新性地开展牛乳腺炎无乳链球菌Ia亚型PI-2a菌毛岛屿AP1、AP2、BP亚单位不同组合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护试验,获得了AP1-BP-AP2融合抗原的免疫保护效果为最佳的结论,为进一步开发无乳链球菌性乳腺炎防控的亚单位疫苗及其流行病学检测试剂盒提供了实验依据。

牛乳腺炎粪肠球菌cylA基因对牛外周血单核巨噬细胞完全吞噬功能的影响

探索奶牛乳腺炎粪肠球菌cylA基因对体外培养的单核巨噬细胞完全吞噬功能的影响。通过体外培养牛外周血单核巨噬细胞(BMC-7),利用牛乳腺炎粪肠球菌野生型菌株(BME1708)和cylA基因敲除突变株(BME1708ΔcylA)按照不同时间梯度侵染BMC-7,利用台酚蓝染色显微镜观察法,统计不同时间BMC-7对BME1708和BME1708ΔcylA的吞噬率和吞噬指数的差异。结果表明随着时间的延续,吞噬率和吞噬指数存在动态变化,至48 h时BMC-7对BME1708的吞噬率和吞噬指数分别为25%和2.3,而对BME1708ΔcylA的吞噬率和吞噬指数分别为50%和5.5。随着时间的进一步延续,巨噬细胞开始死亡。说明溶血素cylA基因阳性的粪肠球菌菌株对巨噬细胞的吞噬作用具有一定的负调控作用,并且在巨噬细胞内的存活率相对高,在单核巨噬细胞内存在一定的“内生”现象,这一现象可能是由该致病菌引起的牛乳腺炎常反复、难治愈的分子机制之一。

内蒙古地区牛乳腺炎粪肠球菌临床分离株全基因组测序与生物信息学分析

目的对内蒙古地区奶牛乳腺炎临床分离粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的基因组进行测序,并预测和分析其生物信息学特征。方法本实验以“内蒙古自治区乳源性致病菌防控工程技术研究中心”分离的粪肠球菌临床分离菌株FC(BME1708)为对象,利用PacBio RS II平台进行全基因组测序,分别使用RNAmmer和tRNAscan-SE软件对菌株基因组中的rRNA和tRNA进行预测,并对测序基因序列进行数据分析、基因注释、耐药性及毒力因子分析。结果测序组装后结果显示,该菌株基因组大小为2934454 bp,其中包含5个双股环状质粒DNA、61个tRNA、12个rRNA,蛋白总数为3151个。耐药性及毒力因子基因预测结果显示,该菌株对庆大霉素、链霉素、β内酰胺、青霉素、四环素、万古霉素等27类抗生素耐药,存在cyl、esp、ace、gel、efaA等82个相关毒力因子。结论已将本次分离的粪肠球菌基因组测序结果登录于GenBank(登录号:CP028835.1),该实验结果将为后续致病及免疫调控机理研究,以及防控策略的制定提供了可靠的生物信息数据。