内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌的分离与鉴定

对内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌进行分离并鉴定。以蒙古族传统发酵乳为材料,采用传统的细菌纯培养分离方法分离乳酸菌株,通过形态学特征及生理生化试验初步确定乳酸菌的基础上,进一步利用细菌16S r DNA基因序列分析和系统发育进化树构建,对其种属进行分析鉴定。分析鉴定结果显示,分离得到的29株乳酸菌共鉴定为2个属,6个种。2个属分别为乳酸杆菌属(Lactobacillus)和肠球菌属(Entercoccus),6个种分别为短乳杆菌(Levilaccillus brevis,4株)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum,8株)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis,9株)、鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum,3株)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii,1株)、耐久肠球菌(Enterococcus durans,4株)。该研究采集的发酵乳样品中乳酸菌资源丰富,代表着内蒙古蒙古族传统发酵乳制品中优势性乳酸菌菌种,为优良发酵剂的研发奠定了微生物资源基础。

内蒙古地区牛乳腺炎致病性粪肠球菌表面蛋白esp基因的克隆、表达及抗原性分析

目的 克隆、表达内蒙古地区奶牛乳腺炎临床分离粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的表面蛋白esp基因,对表达产物进行抗原性鉴定及生物信息学分析。方法 以Genbank公布的序列号为CP045045.1粪肠球菌esp基因DNA为模板设计1对引物,对esp基因进行克隆、测序,构建重组表达载体pET-30a(+)-esp后进行原核表达,对表达蛋白进行Western blot鉴定。利用DNA Star生物信息软件对表达蛋白的空间构象,理化特性,跨膜区,抗原性等进行预测分析。结果 测序显示,克隆的esp基因序列长度为776 bp,与NCBI公布的esp序列(CP045045.1)相似度为100%。经PCR及酶切鉴定,重组表达质粒pET30a(+)-esp构建正确。将其转化至原核表达工程菌BL21后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示该蛋白的相对分子质量约28×10^(3)。Western blot分析显示,纯化的重组蛋白能够被相应小鼠抗血清识别。DNAStar生物信息学软件分析显示,该蛋白相对分子质量为37×10^(3),等电点为4.33,带负电荷残基总数54个,带正电荷残基总数30个,分子式为C_(1190)H_(1899)N_(309)O_(438),α螺旋占6.98%,β折叠占1.94%,无规则折叠占68.6%;其二级结构以无规则卷曲为主,表面存在较多抗原表位;6-25位氨基酸之间存在跨膜区域,推测该蛋白具有跨膜特性。抗原性分析显示,esp基因编码蛋白在14-55、59-170、186-197、206-255位氨基酸残基区段存在良好的抗原可及性,以59-170位区间抗原可及性较为集中。结论 内蒙古地区分离的牛乳腺炎致病性粪肠球菌esp基因编码蛋白具有良好的抗原性,可作为该菌感染检测靶标候选抗原。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、BP、AP2三基因的串联表达及其免疫原性研究

为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重叠延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,表达蛋白经亲和层析纯化后进行western blot鉴定和小鼠免疫实验。结果表明,AP1-AP2-BP融合抗原具有良好的反应原性和免疫原性。本研究为进一步研究无乳链球菌基于AP1-BP-AP2融合蛋白的致病机制、检测制剂及亚单位疫苗研制提供了实验依据。

人畜结核分枝杆菌快速检测技术研究进展

牛结核分枝杆菌病是一种人畜共患疫病,由牛分枝杆菌所引起.牛感染分枝杆菌后不仅引起乳房炎、结核性胸膜炎等疫病,而且还残留于牛乳中影响牛奶品质和产奶量,给奶业和公共安全带来极大危害.由于牛结核分枝杆菌病是一种慢性消耗性疫病,根据我国农业农村部对牛结核病的防控办法,通过快速、精准检出及淘汰处置是防控此疫病发生发展的关键措施.本文主要综述牛结核分枝杆菌检测技术研究进展,并对其优点及不足进行评价,为相关研究人员研发新型快速、便捷、精准的检测技术产品提供理论依据.

内蒙古地区乳源性金黄色葡萄球菌的分离与分子鉴定

目的对从内蒙古通辽市地区患乳腺炎奶牛乳中分离到的1株疑似金黄色葡萄球菌进行分子鉴定,并建立一种能直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR方法。方法采集疑似金黄色葡萄球菌感染乳腺炎奶牛乳液标本,进行细菌的分离培养,革兰染色、镜检、生化特征鉴定,溶血及药敏试验,并进行16SrDNA序列扩增、测序分析、分子鉴定,采取扩增序列NCBI Blast比对方法建立进化树进行分子进化分析。结果该分离株菌为革兰染色阳性,菌落形态、菌体形态、培养特性与分子特征均与金黄色葡萄球菌相符。PCR扩增出金黄色葡萄球菌16SrDNA序列,长度为611bp,该序列与GenBank公布的葡萄球菌(KY784112.1)16SrDNA序列相似性为100%,进化树分析该分离株与KY784112.1金黄色葡萄球菌属于近缘发育分枝。结论分离菌株为乳源性金黄色葡萄球菌,采用PCR法可作出快速检测。

一株裂解多重耐药性无乳链球菌噬菌体的分离及生物特性分析

噬菌体是一类能够感染细菌的病毒。利用噬菌体控制细菌感染的噬菌体疗法,具有特异性强、自我增殖快、抗菌能力强和研发时间短等优点,特别是对多重耐药菌感染的治疗具有广阔的发展前景。本试验利用乳腺炎临床分离的多重耐药无乳链球菌作为宿主,从牛生存环境中的污水样、粪水样中分离特异性裂解噬菌体,并对其生长特性进行分析研究。结果表明,该试验已成功分离出1株多重耐药性粪肠球菌裂解性噬菌体,噬菌斑清晰,潜伏期短,增长速度快。临床分离到的多重耐药性无乳链球菌有着较好的抑菌效果,对自然环境下温度、酸碱度的耐受性较强,为多重耐药菌的治疗提供了理论依据和技术支撑。

牛结核分枝杆菌早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83基因的串联表达及其抗原性鉴定

为获得一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌(MB)感染早期标识物MPB70、MPB83分泌性蛋白的串联抗原蛋白,本研究利用DNAStar生物信息软件对MB感染早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83抗原结构区域进行预测后设计合成相应引物,并在两个片段之间引入16位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术获得MBP70与MBP83基因的抗原优势区核苷酸串联片段,将其连接至原核表达载体pGEX-6p-1中经诱导、表达,结果显示构建的重组表达载体获得高效表达,目的抗原蛋白的分子质量约58ku,纯化后重组蛋白的纯度>90%,经免疫BALB/c小鼠4次后,抗体效价达到1∶51200。本实验获得了具有明显抗原活性的MB感染早期分泌性蛋白串联抗原MPB70+MPB83,为后续进一步研发MB早期感染标识物快速检测试剂盒奠定了基础。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿亚基不同组合融合抗原对BALB/c小鼠免疫保护性实验

为评价牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿亚基不同组合融合蛋白AP1-AP2、 AP1-BP、 BP-AP2、AP1-BP-AP2对BALB/c小鼠的免疫保护性,本研究取各融合蛋白与同体积的弗氏佐剂进行乳化,分别制备融合抗原免疫制剂,4种免疫制剂均以50μg/只对小鼠进行4次免疫后均产生了较高滴度的抗体,其中AP1-BP-AP2融合抗原产生的抗体滴度水平最高,可达1∶25 600。在免疫后第50 d时利用104 cfu/mL乳腺炎无乳链球菌攻毒,每天观察记录小鼠的精神状态、食量变化等生理状态。攻毒试验结果显示,4种不同融合抗原均显示不同程度的免疫保护性,其中AP1-BP-AP2融合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护性为最佳,其免疫保护指数PI达到80%。本研究首次创新性地开展牛乳腺炎无乳链球菌Ia亚型PI-2a菌毛岛屿AP1、AP2、BP亚单位不同组合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护试验,获得了AP1-BP-AP2融合抗原的免疫保护效果为最佳的结论,为进一步开发无乳链球菌性乳腺炎防控的亚单位疫苗及其流行病学检测试剂盒提供了实验依据。

牛乳腺炎粪肠球菌cylA基因对牛外周血单核巨噬细胞完全吞噬功能的影响

探索奶牛乳腺炎粪肠球菌cylA基因对体外培养的单核巨噬细胞完全吞噬功能的影响。通过体外培养牛外周血单核巨噬细胞(BMC-7),利用牛乳腺炎粪肠球菌野生型菌株(BME1708)和cylA基因敲除突变株(BME1708ΔcylA)按照不同时间梯度侵染BMC-7,利用台酚蓝染色显微镜观察法,统计不同时间BMC-7对BME1708和BME1708ΔcylA的吞噬率和吞噬指数的差异。结果表明随着时间的延续,吞噬率和吞噬指数存在动态变化,至48 h时BMC-7对BME1708的吞噬率和吞噬指数分别为25%和2.3,而对BME1708ΔcylA的吞噬率和吞噬指数分别为50%和5.5。随着时间的进一步延续,巨噬细胞开始死亡。说明溶血素cylA基因阳性的粪肠球菌菌株对巨噬细胞的吞噬作用具有一定的负调控作用,并且在巨噬细胞内的存活率相对高,在单核巨噬细胞内存在一定的“内生”现象,这一现象可能是由该致病菌引起的牛乳腺炎常反复、难治愈的分子机制之一。

内蒙古地区牛乳腺炎粪肠球菌临床分离株全基因组测序与生物信息学分析

目的对内蒙古地区奶牛乳腺炎临床分离粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的基因组进行测序,并预测和分析其生物信息学特征。方法本实验以“内蒙古自治区乳源性致病菌防控工程技术研究中心”分离的粪肠球菌临床分离菌株FC(BME1708)为对象,利用PacBio RS II平台进行全基因组测序,分别使用RNAmmer和tRNAscan-SE软件对菌株基因组中的rRNA和tRNA进行预测,并对测序基因序列进行数据分析、基因注释、耐药性及毒力因子分析。结果测序组装后结果显示,该菌株基因组大小为2934454 bp,其中包含5个双股环状质粒DNA、61个tRNA、12个rRNA,蛋白总数为3151个。耐药性及毒力因子基因预测结果显示,该菌株对庆大霉素、链霉素、β内酰胺、青霉素、四环素、万古霉素等27类抗生素耐药,存在cyl、esp、ace、gel、efaA等82个相关毒力因子。结论已将本次分离的粪肠球菌基因组测序结果登录于GenBank(登录号:CP028835.1),该实验结果将为后续致病及免疫调控机理研究,以及防控策略的制定提供了可靠的生物信息数据。

奶牛乳腺炎无乳链球菌Hly基因抗原表位的截短序列表达及抗原性研究

目的截短克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌溶血素(Hly)基因抗原优势区域,构建重组表达载体,实现原核细胞高效表达,进而对表达产物进行抗原性分析。方法根据GenBank公布的牛源无乳链球菌(CP018623.1)hly基因序列设计引物,以牛乳源性无乳链球菌1886菌株基因组DNA为模板,PCR扩增hly基因片段,构建重组质粒pET-30a-hly并转化至E.coli/BL21(DE3)中,经IPTG诱导高效表达后,并进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。表达产物纯化后经水溶性501佐剂乳化,免疫昆明小白鼠,采用间接ELISA法测定血清抗体滴度。结果成功克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌1886菌株hly基因,其碱基长度513bp,编码171个氨基酸殘基,与GenBank公布的牛源无乳链球菌(CP018623.1)Hly基因核苷酸序列及其编码氨基酸序列相似性为100%。重组质粒表达的重组蛋白分子质量单位约为30×103,纯化蛋白含量为1.2mg/ml。Western blot检测重组蛋白可被相应抗体识别。ELISA检测重组蛋白免疫小鼠血清抗体滴度为1∶25 600。结论内蒙古分离株无乳链球菌Ia型hly基因抗原优势序列编码多肽具有良好的抗原性,可以作为候选免疫抗原,为研究其致病机制及新型疫苗奠设计奠定了基础。

牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素CylE基因对牛巨噬细胞炎性细胞因子的转录和表达及对信号通路MAPK的影响机制研究

目的探讨牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素CylE基因对牛巨噬细胞吞噬功能的免疫调理分子机制。方法利用牛乳腺炎无乳链球菌临床分离野生菌株及β溶血素CylE基因缺失突变株对牛巨噬细胞进行侵染,提取侵染细胞的总mRNA;利用qPCR检测细胞因子Il-8、Il-10、Il-12、TNFα及NOS2的转录水平,ELISA检测相应表达水平。在此基础上,利用免疫印迹实验鉴定无乳链球菌β溶血CylE基因对MAPK信号通路下游接头分子p-38、p44/42的表达及其磷酸化水平的影响,以明确其调控该信号通路的分子机制。结果巨噬细胞-GBS^(WI)组与巨噬细胞-GBS^(ΔcyIE)组相比,IL-10、TNF-α细胞因子上调,而IL-8、IL-12、NOS2细胞因子表达水平降低,表明无乳链球菌β溶血素CylE对细胞因子IL-10、TNF-α的影响结果一致,相对转录水平均上调,同时抑制细胞因子IL-8、IL-12及NOS2的转录。巨噬细胞-GBS;组与巨噬细胞-GBS;组相比,IL-10及TNF-α的相对表达量增加,而IL-8及IL-12的相对表达量下调,差异均具有统计学意义(均P>0.05),NOS2的相对表达量降低。对MAPK信号通路下游分子磷酸化检测结果显示,无乳链球菌β溶血素CylE基因可激活其下游接头分子p38磷酸化为p-p38,不能激活下游分子p44/42。结论根据上述结果,p38 MAPK是无乳链球菌溶血素CylE基因发挥免疫调控的识别途径,可能成为对其进行识别钝化,实现信号通路封闭,提高对牛乳腺炎预防与治疗有效性的新靶位,为有效防控该病原菌的危害,保障乳源安全提供新的思路和有效途径。

基于奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿rAP1-BP-AP2重组蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立一种快速准确高效的检测奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿抗原相应抗体的检测方法,本研究以牛乳腺炎无乳链球菌Ia型PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、AP2及骨架蛋白BP 3基因串联表达的重组蛋白为ELISA包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立了奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体的间接ELISA检测方法。优化后抗原的最佳包被量为5.0μg/孔,血清样品最佳稀释倍数为1∶40,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶5 000。对S.agalactiae、S.pyogens、E.coli、S.aureus、S.epidermidis阳性血清进行检测结果显示,后4种阳性对照血清未出现阳性反应,表明该方法具有良好的特异性;对已知牛无乳链球菌阳性血清倍比稀释后进行检测时,当稀释倍数达到1:12 800时仍出现阳性结果,表明该方法具有较高的敏感度;重复性试验显示批内变异系数为2.41%~8.89%,批间试验变异系数为7.53%~10.46%;用该方法对426份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,结果显示,其样品阳性检出率为45.07%。本研究首次基于乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿三联重组蛋白建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种准确、可靠的检测方法。

牛结核分枝杆菌MPB70+83MAb的制备及胶体金免疫层析试纸条的初步研制

为制备牛结核分枝杆菌(MB)感染早期分泌性蛋白MPB70+83的胶体金标记免疫层析试剂条,本研究将构建的重组大肠杆菌p ET30a(+)-MPB70+83/BL21诱导表达,经纯化后免疫小鼠,制备MPB70+83融合蛋白的单克隆抗体(MAb),对MAb标记胶体金后制备检测试纸,并确定其特异性、灵敏度等技术指标。结果显示,获得分子量为39 ku的MPB70+83融合蛋白,经纯化后重组蛋白的纯度>95%,经4次免疫BALB/c小鼠后,最终获得3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4H6、5A2、4D11,小鼠腹水MAb效价分别达到1∶12800,1∶12800,1∶25600。制备的腹水MAb均经纯化后浓度分别为2.1 mg/m L、1.8 mg/mL、2.5 mg/mL。对杂交瘤细胞经15代培养,MAb均具有良好的稳定性。利用4D11 MAb标记金颗粒,4H6 MAb包被检测线,并对不同培养物人工污染健康牛血清样品进行检测,结果显示,胶体金试纸对人工污染MB培养物的健康牛血清出现阳性反应,对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌培养物人工污染的健康牛血清的检测均为阴性,最低可以检测到1∶2500倍稀释的MB培养上清。本研究为牛结核分枝杆菌感染的快速检测提供可行技术手段。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP基因亚单位抗体的制备

目的构建牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a亚单位重组抗原AP_1-AP_2-BP,并制备其多亚单位抗体,为后期研制新型免疫疫苗和检测试剂提供实验基础。方法利用延伸PCR技术构建了AP_1-AP_2-BP三联基因,并将该串联基因进行转化,诱导,表达,纯化,并将纯化蛋白制作为抗原,对家兔免疫,制备多亚单位抗体,并通过亲和层析的方式从免疫后的血清中获得纯化的IgG,完成多亚单位抗体的制备。结果 AP_1-AP_2-BP三基因串联重组工程菌株通过诱导、表达,对产物亲和层析等方法获得的纯化蛋白,其相对分子质量为65 kDa,其含量达到3.3 mg/mL,并具有较好的免疫原性。经间接ELISA可知,经过4周的免疫抗体的滴度已达到1∶5 600的水平。通过Protein A280测量数据表明,纯化后的IgG的含量高达9.1 mg/mL。结论牛乳腺炎无乳链球菌的菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP三基因串联重组工程菌经诱导、表达后获得的纯化蛋白AP_1-AP_2-BP多亚单位抗原有较好的免疫原性,为制备相应多亚单位抗体的制备提供了良好的多价抗原,同时为将研制新型工程疫苗及检测试剂提供了科学研究基础。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚基单克隆抗体胶体金标记试纸条制备

目的本研究通过优化牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚单位单克隆抗体的性能,制备胶体金标记检测牛乳腺炎无乳链球菌的试纸条。方法利用pET30a(+)-BP重组质粒表达蛋白纯化物免疫小鼠,无菌取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选杂交瘤细胞,制备单克隆抗体,对单克隆抗体进行胶体金标记后制备检测试剂盒,并确定其灵敏度、特异性等技术指标。结果经数轮筛选,获得1株阳性杂交瘤细胞株,抗体效价达到1∶25600。胶体金标记试纸条灵敏度量达到10~6 CFU/mL。特异性测试结果表明,胶体金标记试纸条与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌、化脓性链球菌培养物人工污染的牛乳样均无阳性反应,只与无乳链球菌乳样出现阳性结果。结论该胶体金标记免疫层析试纸条,具有实际应用价值,将为牛乳腺炎的筛查检测提供新型、便捷的技术产品。

奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a骨架蛋白BP基因的克隆及其抗原性预测

目的克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿BP基因片段并进行序列分析。方法根据GenBank已公布牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的BP基因序列,采用Primer 5.0软件设计1对特异性引物,以内蒙古通辽地区分离的乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板PCR扩增BP基因片段,并进行生物信息学分析。结果克隆的BP基因序列大小为609bp,编码203个氨基酸残基,其基因序列与GenBank上公布的牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的BP基因(EU930008)相似性为100%。菌毛岛屿骨架蛋白BP二级结构的α螺旋在N端分布较多;β折叠较丰富,且分布于C端较多;无规则卷曲分布较均匀。菌毛岛屿骨架蛋白BP的亲水区分布较广,遍布于整个多肽区,属于亲水性蛋白。BP蛋白分子表面可及性较高,区域占比达57.0%,且抗原性较好。结论奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛骨架蛋白BP基因具有高度保守性,其编码蛋白具有良好的抗原性,可作为防治无乳链球菌性乳腺炎的候选抗原序列。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、BP主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定

目的构建无乳链球菌菌毛岛屿辅助蛋白AP1、菌毛骨架蛋白BP主要抗原域串联表达重组载体,对表达产物进行抗原性分析及鉴定。方法利用DNAstar Protean功能筛选AP1和BP主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、BP主要抗原决定簇基因区,PCR扩增串联体基因片段,克隆至pET-30a(+)载体后转化BL21(DE3)细胞,表达的目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。结果 PCR扩增出321bp的AP1和660bp的BP主要抗原域,经重叠延伸PCR获得966bp的AP1、BP串联体基因片段,DNA测序表明无碱基缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经IPTG诱导能可溶性表达分子质量约45ku的目的蛋白,纯化后重组蛋白的纯度≥95%,Western blot分析表明,重组融合蛋白能被兔源抗无乳链球菌阳性血清识别。结论重叠延伸PCR获得AP1、BP主要抗原域串联体,构建的pET-30a(+)/AP1+BP重组表达载体能以包涵体形式表达目的蛋白,表达产物具有良好的反应原性,为研究基于AP1、BP蛋白的致病机制及其免疫活性奠定了实验基础。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白BP、AP2主要抗原域的串联表达及其免疫活性

目的构建无乳链球菌(group B Streptococcus agalactea,GBS)菌毛岛屿辅助蛋白BP、AP2主要抗原表位域融合表达重组质粒,进行高效表达,并分析其免疫活性。方法利用DNAstar生物信息软件Protean功能筛选BP和AP2主要抗原表位域,并引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术扩增融合BP、AP2主要抗原表位域基因,PCR扩增串联体基因片段,克隆至原核表达载体p ET-30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)/BP+AP2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白BP+AP2经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并免疫昆明小白鼠,检测其免疫原性。结果 PCR扩增出675 bp的BP和759 bp的AP2主要抗原域,经重叠延伸PCR获得了1 380 bp的BP、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达质粒经诱导后获得表达,目的蛋白相对分子质量约55 000,主要以包涵体形式存在,纯化后纯度达96%以上,浓度为2.05 mg/ml。纯化的融合蛋白能被兔抗GBS阳性血清所识别,且具有良好的免疫原性。结论构建了GBS BP、AP2主要抗原表位域串联体重组表达质粒p ET-30a(+)/BP+AP2,表达产物具有良好的免疫活性,为进一步研究基于BP、AP2蛋白的致病机制、诊断制剂及基因工程疫苗奠定了基础。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、AP2主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定

利用DNAStar Protean功能筛选AP1和AP2主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、AP2主要抗原域基因,PCR扩增串联体基因片段,将其克隆至pET-30a（＋）载体,转化BL21（DM3）细胞,进行高效表达,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。PCR扩增出320bp的AP1和759bp的AP2主要抗原域,经重叠延伸PCR获得了1 065bp的AP1、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经诱导能够可溶性表达,目的蛋白相对分子质量大小约46 000,纯化后重组蛋白的纯度〉96%,Western blot分析重组融合蛋白结果表明,能够被兔源抗无乳链球菌阳性血清所识别。重叠延伸PCR获得了AP1、AP2主要抗原域串联体,构建了pET-30a（＋）/AP1＋AP2重组表达载体,诱导目的蛋白呈可溶性表达,表达产物具有良好的免疫反应原性,为进一步研究基于AP1、AP2蛋白的致病机制,检测制剂及疫苗奠定了试验基础。