内蒙古牛呼吸道合胞体病毒的分离鉴定及其全基因组分析

为确定引起内蒙古地区3月龄~6月龄荷斯坦犊牛暴发呼吸系统疾病的病原,并分析其基因组序列,本研究对病死犊牛剖检并观察其各脏器的剖检病变,制备各组织病理切片,观察其组织病变。结果可见犊牛肺脏呈深红色有光泽的肌肉样实变,心脏肥大,肝脏表面散在细小的结节状灰白色病灶,肾脏表面散在细小深红色出血点;组织病理学观察可见典型间质性肺炎,多数各级细支气管腔和肺泡腔内巨噬细胞和淋巴细胞大量增生和浸润,偶见合胞体细胞,在各级细支气管部分黏膜上皮细胞浆内有大小不等的圆形红染的病毒包涵体;轻度纤维化和小坏死灶的变质性肝炎,急性炎性脾肿,多发性小出血灶的慢性硬化性肾小球肾炎。进一步进行RT-PCR检测,结果显示,扩增获得约600 bp的目的条带,测序后与GenBank中相关基因序列比对,结果显示目的基因与牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)美国分离株USII/S1(KU159366)的同源性最高(98.42%),表明该地区某牧场犊牛感染了BRSV。将该病例肺组织研磨上清液接种牛肾细胞(MDBK)盲传3代出现典型的细胞病变,经RT-PCR检测确认为BRSV,进一步表明分离到1株BRSV,命名为IM BRSV-39。分段扩增IM BRSV-39株的全基因组序列,经测序后拼接获得长度为15130 bp的BRSV全基因组序列。采用MegAlign软件分析IM BRSV-39株的全基因组序列、G基因序列和F基因序列的同源性及突变位点;采用MEGA 11软件构建分离株全基因组进化树分析其遗传进化关系。结果显示,IM BRSV-39株的全基因组序列、G基因和F基因序列均与BRSVⅢ亚型分离株相应基因序列的同源性最高、且位于同一进化分支,证实IM BRSV-39株属于BRSVⅢ亚型;突变位点分析结果显示:与BRSVⅢ亚型参考株相比,IM BRSV-39株G基因序列存在7个突变位点,F基因序列存在12个突变位点;G蛋白氨基酸序列存在4个突变位点,其中L13H处在G蛋白的胞质结构域(aa1~aa37);Y^(127)H、I^(139)T、P^(177)L、A^(186)T处在G蛋白的胞外结构域(aa66~aa257);F蛋白氨基酸序列存在5个氨基酸突变位点,其中M^(4)T、M^(7)T、S^(14)C处在F蛋白氨基末端信号肽区(aa1~aa26)。本研究检测并分离到1株BSRV,揭示了该病毒基因组的遗传进化特征,为国内BRSV的深入研究奠定了基础。

内蒙古地区神经致病型马疱疹病毒1型的分离与鉴定

为调查内蒙古四子王旗某马场马流产是否由马疱疹病毒1型(EHV-1)感染导致,本研究采集该场马流产胎儿肝、脾等组织,将组织研磨上清液接种MDBK细胞,盲传5代,待出现细胞病变时收集细胞及培养上清,通过gB基因的PCR及透射电镜对分离病毒进行鉴定,采用2代测序技术对分离病毒全基因组测序,并进行分离病毒gB基因的同源性及遗传进化分析。采用SnapGene6.0.2软件分析分离病毒ORF30基因及其编码氨基酸序列。结果显示,组织上清液接种MDBK细胞并盲传5代后,细胞出现典型的圆缩、融合、脱落和聚堆成葡萄串状等细胞病变特征;EHV-1 gB基因的PCR检测结果呈阳性;电镜观察可见疱疹病毒典型的形态特征,表明分离到1株EHV-1,命名为EHV-1-NM2021。同源性分析结果显示:分离株EHV-1-NM2021 gB基因序列与国内外EHV-1参考株gB基因序列的同源性为97.7%~100%;构建gB基因的系统发育进化树,结果显示该基因与EHV-1德国株(RacL11)、澳大利亚株(438-77)处于同一进化分支,亲缘关系较近。此外,ORF30基因序列及氨基酸序列比对结果显示,EHV-1-NM2021 ORF30基因nt2254为鸟嘌呤(G),aa752为天冬氨酸(D),该分离株为神经致病型病毒。本研究首次在内蒙古鉴定并分离到神经致病型EHV-1,丰富了国内EHV-1的流行病学数据库,为EHV-1感染所导致马流产的防控奠定了研究基础。

内蒙古自治区大兴安岭林区游离蜱及其疏螺旋体调查

目的了解内蒙古自治区(内蒙古)大兴安岭林区蜱类的群落结构及携带疏螺旋体本底情况。方法于2019-2021年春夏季采集游离蜱标本,经形态学和分子生物学法鉴定蜱种。解剖摘取蜱唾液腺提取DNA,以16S rRNA的荧光定量PCR(qPCR)技术作为疏螺旋体初筛,阳性标本再以疏螺旋体鞭毛蛋白B(flaB)靶基因进行PCR检测和测序确认。扩增序列测序后进行BLAST同源性比对分析,使用MEGA 7.0软件构建系统发育树。结果共采获成蜱2755只,隶属于3属4种。其中全沟硬蜱为该地区的优势蜱种,占采集总数的85.6%。PCR检测结果显示,疏螺旋体的阳性率为24.7%,其中回归热螺旋体、莱姆病螺旋体的阳性率分别为3.8%和20.9%。在采获的蜱中,全沟硬蜱和嗜群血蜱均检测到莱姆病螺旋体,回归热螺旋体仅在全沟硬蜱中发现。测序获得的序列经BLAST比对和系统发育分析结果显示,源于全沟硬蜱的一些序列分别与Borrelia afzelii(CP003882)、B.garinii(CP003866)、B.miyamotoi(AB900798)、Borrelia sp(.LC170020)有高度同源性(97.5%~100%);源于嗜群血蜱的序列也与B.garinii(CP003866)聚在一簇。不同蜱种携带疏螺旋体的种类及携带率存在较大差异。仅全沟硬蜱存在2种螺旋体的混合感染。结论该地区蜱类中广泛存在以莱姆病螺旋体和回归热螺旋体为主的蜱媒疏螺旋体菌群,且携带率较高,有必要针对性地加强蜱媒疾病的防控工作。

内蒙古大兴安岭林区牙克石段的蜱种及蜱携病原体感染调查

目的调查内蒙古东部大兴安岭林区牙克石段的蜱种分布及病原体感染状况。方法2016-2019年,在东部林区蜱活跃高峰期(5-6月)采用布旗法采集游离蜱标本,使用体视显微镜对蜱初步分类;提取蜱全基因组DNA,采用斑点热立克次体、无形体属、埃立克体属、莱姆病螺旋体和新型回归热螺旋体病原体的特异性基因进行PCR检测。结果本次共采集蜱虫2786只,通过体视显微镜和基因检测分析,隶属于1科3属4种,分别为全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)、嗜群血蜱(Haemaphysalinae concinna)、日本血蜱(Haemaphysalinae japonica)、森林革蜱(Dermacentor silvarum)。其中,全沟硬蜱(78.6%,2191/2786)、嗜群血蜱(15.9%,442/2786)为本地区的优势蜱种。在大兴安岭林区牙克石段的7个采样地区的蜱中,乌奴耳镇斑点热立克次体检出率最高,为74.2%(222/299);博克图镇无形体属检出率较高,为18.9%(39/206);库都尔镇埃立克体属、莱姆病螺旋体、新型回归热螺旋体的检出率均较高,分别为26.1%(12/46)、76.1%(35/46)、13.0%(6/46)。除新型回归热螺旋体外,其他4种病原体的检出率雄蜱均高于雌蜱(P<0.05);成蜱的无形体、埃立克体、莱姆病螺旋体检出率均高于幼蜱(P<0.05)。大兴安岭林区牙克石段蜱的复合感染率为19.5%(544/2786)。其中,免渡河镇蜱携2种病原体复合感染率为40.6%(186/458),乌奴耳镇蜱携3种及以上病原体复合感染率分别是47.4%(36/76)、90%(9/10)。结论大兴安岭林区牙克石段共存在4种蜱,蜱携莱姆病螺旋体最普遍,其中免渡河镇和乌奴耳镇的蜱普遍携带多种病原体,需重点加强该地区蜱媒传染病的监测和预防。

内蒙古自治区巴彦淖尔地区鼠类携带疏螺旋体调查研究

目的了解内蒙古自治区(内蒙古)巴彦淖尔地区鼠类分布、疏螺旋体感染及其基因型等,为该地疫情防控和风险评估提供基础数据。方法于2015-2016年每年的4-6月、9-10月采用夹夜法捕获鼠类,采用特异性PCR扩增法对标本进行疏螺旋体检测,并通过测序和序列比对等进行疏螺旋体基因型分析。结果共捕获鼠类480只,其中子午沙鼠(174只)和长爪沙鼠(124只)数量居多,为该地优势鼠种。鼠类脾脏标本经PCR检测,共发现8份疏螺旋体fla B和16S rDNA基因阳性标本,阳性率为1.67%,其中毛足鼠和长爪沙鼠的阳性率分别为7.14%(2/28)和4.84%(6/124)。对阳性标本基因片段进行序列分析发现,感染的疏螺旋体为Borrelia afzelii和B.garinii。结论内蒙古巴彦淖尔地区鼠类携带的疏螺旋体以B.afzelii和B.garinii为主,应加强该病原体的检测和莱姆病防制。

猫传染性腹膜炎病毒的检测及ORF 7 ab、N和S基因遗传进化分析

采用剖检、组织病理学和免疫组织化学的方法检测并确诊了2例猫传染性腹膜炎(FIP)病例,并通过RT-PCR扩增2例组织样品中猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的ORF 7 ab、N和S基因,测序后进行基因遗传进化分析,阐明病毒的遗传进化特征。结果显示,2个病例均表现典型的混合型FIP的大体病变,腹腔积满浆液纤维素性渗出物,在腹腔浆膜面散在或弥漫分布细小的灰白色结节。组织病理学显示腹膜表面上附着大小不等的炎性细胞浸润灶,以及坏死性肠炎、间质性胰腺炎和间质性肺炎。免疫组织化学染色结果显示,FPIV特异性的强阳性信号见于炎性细胞浸润灶、脾脏和胰腺内。基因同源性和遗传进化分析结果显示,2例基因均属于FCoVⅠ型。IMAU No.11685与浙江杭州ZJU1709毒株(MT239440)同源性最高,亲缘关系最近;IMAU No.11824与湖北武汉QS毒株(MW030108)同源性最高,亲缘关系最近。说明2例FIPV与国内流行毒株起源于共同祖先,其中ORF 7 ab、N基因相对保守,变异不明显,S基因发生一定的变异。研究结果可为我国FIP的分子流行病学研究和防控提供参考。

一例赤大袋鼠梭菌性肠炎的诊断和病原分离鉴定

通过临床症状、尸体剖检、组织病理学、毒素实验和细菌分离鉴定的方法确诊了1例由A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)引起的赤大袋鼠(Macropus rufus)梭菌性肠炎的自然病例。动物园1只成年赤大袋鼠突然精神沉郁、厌食,于20 h后死亡,尸体角弓反张,腹围膨大。尸体剖检和组织学检查表明:胃肠道、肝脏和肾脏出现具有梭菌性肠炎证病意义的病变。小白鼠毒素实验结果显示,血样肠内容物内有急性致死性毒素。从出血的肠黏膜面分离到单一、有芽孢、粗大的革兰阳性杆菌,经产气荚膜梭菌毒素基因型多重PCR鉴定为A型产气荚膜梭菌。研究结果可为赤大袋鼠梭菌性肠炎的诊断和防控提供依据。

内蒙古中西部草原蜱媒病原体多样性及基因型分析

目的了解内蒙古中西部草原蜱类的群落结构、携带病原体多样性及基因型。方法于2016-2019年春夏季,在内蒙古中西部草原,采用动物体表搜集法采集蜱标本,进行蜱种鉴定。解剖摘取蜱的唾液腺并提取基因组DNA,以斑点热立克次体柠檬酸合成酶A (gltA)、疏螺旋体以鞭毛蛋白B (flaB)、埃立克体属以外膜蛋白质1 (omp1)、无形体属主要表面蛋白2 (msp2)为靶基因进行PCR扩增初筛。立克次体gltA初筛阳性样品经限制性片段长度多态性(RFLP)分类,再根据蜱种和地区每类选20~30个代表性样品进行gltA、立克次体外膜蛋白A (rOmpA)基因测序。扩增序列测序后用BLAST、 Clustal W和MEGA 7.0软件进行同源性分析,以邻接法构建系统进化树。结果共采集成蜱3 822只,经形态学特征和特异性18S r RNA基因分型法鉴定,隶属于2属3种,分别为草原革蜱、亚东璃眼蜱和边缘璃眼蜱,其中草原革蜱占55.7%(2 129/3 822)、亚东璃眼蜱占30.0%(1 147/3 822),为该地区的优势蜱种。PCR检测结果显示,立克次体gltA基因阳性蜱1 899只,阳性率为49.7%(1 899/3 822), gltA基因阳性样品根据RFLP结果分为两类,两类样品的gltA基因序列均为581 bp,与R. raoultii (DQ365804)或R. aeschlimanni (KT873466)的同源性为100%;两类样品的rOmpA基因均长367 bp,与R. raoultii (AH015610)或R. aeschlimanni (U83466)的同源性为100%,与gltA基因的结果相符。3 822只蜱中,R. raoultii和R. aeschlimanni的阳性率分别为37.2%(1 422/3 822)和12.5%(477/3 822),其中草原革蜱中分别为58.5%(1 245/2 129)和11.1%(477/2 129);亚东璃眼蜱中分别为15.4%(177/1 147)和0;边缘璃眼蜱中分别为0和44.0%(240/546)。疏螺旋体flaB基因阳性蜱28只,阳性率为0.7%(28/3 822),其中草原革蜱中为0.8%(16/2 129),亚东璃眼蜱为1.0%(12/1 147)。共获得疏螺旋体flaB基因序列10条,与莱姆病主要病原体B. garinii (AB035602)和B. afzelii PKo (NC008277)的同源性分别为90.6%~100%和95.6%~100%。亚东璃眼蜱中B. garinii和B. afzelii的阳性率分别为0.9%(10/1 147)和0.2%(2/1 147),草原革蜱中均为0.4%(8/2 129)。3 822只蜱中omp1基因阳性1只,TA克隆后获得8个氨基酸序列相同的克隆和3个氨基酸序列存在差异的克隆,11个克隆的氨基酸序列与E. muris的同源性最高,但仅为65%~69%。3 822只蜱中均未检出无形体属菌群。系统进化树分析结果显示,3种蜱感染的立克次体均与R. raoultii和R. aeschlimanni聚在一簇。在获得的10条疏螺旋体菌群flaB基因序列中,源于草原革蜱和亚东璃眼蜱的1条序列与B. garinii聚在一簇,草原革蜱的另1条序列与B. afzelii聚在一簇,其余8条序列与B. garinii和B. afzelii的flaB基因序列处在不同的分支。草原革蜱感染的埃立克体属菌与目前已知的埃立克体属菌群关系较远,形成独自的聚类。结论内蒙古中西部草原存在草原革蜱、亚东璃眼蜱和边缘璃眼蜱,蜱类中广泛存在斑点热立克次体和莱姆病螺旋体的感染,是R. raoultii、R. aeschlimanni、 B. garinii和B. afzelii潜在的自然疫源地。有必要加强该地区蜱媒传染病的预防控制工作。

一例扬子鳄痛风病自然病例的病理诊断

通过尸体剖检、组织病理学方法诊断1例扬子鳄(Alligator sinensis)痛风病自然病例。尸体剖检可见鳄鱼颈部肌肉、胸部肌肉、腹部肌肉、肋间肌肉、胸腔脂肪、腹腔脂肪、肾脏、心脏周围脂肪、心脏表面及切面、二尖瓣与三尖瓣、脾脏、肝脏和胰腺分布大小不等的圆形、针尖状、条索状灰白色尿酸盐沉积灶。组织病理学变化观察显示,扬子鳄的肾脏肾盂、肝脏间质、胃黏膜层、脾脏、肌肉和脂肪均弥漫性分布大小不等的圆形或椭圆形痛风结节,痛风结节中央为向外周呈放射状的红色尿酸盐结晶,边缘为含有多核巨细胞和上皮样细胞的特殊肉芽组织。痛风结节的形成使组织器官的实质细胞有不同程度的坏死。研究结果可为鳄鱼痛风病的诊断提供依据。

捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株与耐药虫株差异miRNA的转录组学分析

为探究捻转血矛线虫的伊维菌素(IVM)敏感虫株与耐药虫株显著差异的microRNA(miRNA)转录谱,发掘其耐药相关的miRNA,本实验采用Illumina Hiseq2000平台分别对捻转血矛线虫IVM敏感虫株与耐药虫株测序,构建cDNA文库,通过质控后采用生物信息学软件筛选捻转血矛线虫IVM敏感与耐药虫株的差异mi RNA。结果显示,捻转血矛线虫的IVM敏感与耐药虫株筛选出转录显著差异的miRNA共375个,其中253个转录上调,122个转录下调。利用RNAhybrid(V6.01)、Miranda(V3.3a)、TargetScan(V7.0)软件对筛选到的mi RNA靶基因进行预测,并取交集作为mi RNA靶基因预测结果,将筛选出显著差异的靶基因通过perl脚本与显著差异的miRNA进行关联分析,结果显示共关联到2106对miRNA-mRNA为负调控关系,其中涉及到477个差异的m RNA和603个差异的miRNA。对显著差异的miRNA靶基因进行GO富集分析,结果显示其中有492个GO terms,包括生物过程(BP)322个、细胞组分(CC)47个、分子功能(MF)123个。按照q值由小到大的顺序排列,被显著富集的有肌细胞发育分化及内肽酶活性等功能;按照富集基因数目由多到少排列,被显著富集的为有机物代谢、细胞代谢等功能。对显著差异的miRNA靶基因进行KEGG信号通路富集分析,按照q值由小到大的顺序排列,被显著富集到的有抗原处理与递呈等信号通路,其中显著差异靶基因也被富集到药物代谢-其他酶等与药物代谢相关的信号通路,以及一些在捻转血矛线虫耐IVM中起重要作用的通路,如:药物代谢细胞色素P450、细胞色素P450对外源药物代谢通路、ABC转运蛋白等。随机从差异miRNA中选10个进行RT-q PCR的验证,结果显示,相对转录水平结果与测序结果一致。本研究上述结果首次证实,捻转血矛线虫对IVM耐药性的产生与其代谢过程、肌细胞的分化发育过程及免疫过程中的某个或多个环节有一定的联系,本研究为进一步探究捻转血矛线虫耐药机制提供了科学依据。

不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的探讨不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)体外向成骨细胞分化的影响。方法取P3代树鼩骨髓间充质干细胞分成7组进行诱导。A组:高糖DMEM+1μmol/L地塞米松+100μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠;B组:高糖DMEM+50 ng/mL BMP-2;C组:高糖DMEM+80 ng/mL BMP-2;D组:高糖DMEM+50μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠+20ng/mL BMP-2; E组:高糖DMEM+1μmol/L地塞米松+100μmol/L维生素C+20 mmol/Lβ-磷酸甘油钠;F组:高糖DMEM+100μmol/L地塞米松+100μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠;G组:DMEM/F12+0.1μmol/L地塞米松+50μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠。诱导18 d后进行碱性磷酸酶和茜素红染色鉴定其诱导分化情况。结果每一组碱性磷酸酶染色呈不同程度的阳性,茜素红染色可在A、B、C、D和E组观察到明显矿化结节。结论 A组、B组、C组、D组和E组可以诱导树鼩BM-MSCs向成骨细胞分化,其中以A组和B组效果最为突出。

捻转血矛线虫耐药虫株与敏感虫株circRNAs差异表达分析

为分析捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株与耐药虫株之间差异表达的circRNAs在调控耐药性中的作用,本研究以捻转血矛线虫敏感虫株和耐药虫株为研究对象,采用Illumina Hiseq 2000平台进行高通量测序及cDNA文库的构建,利用相关生物信息学软件对测得的circRNAs进行差异性分析,同时对来源基因进行GO和KEGG pathway功能富集。运用TargetScan和Miranda软件预测关键circRNAs靶向的miRNAs,探究circRNAs-miRNAs的作用。随后又随机选取5个显著差异的circRNAs,进行RT-qPCR检测并与转录组测序结果进行一致性评定。结果显示:1)敏感虫株与耐药虫株共筛选出677个差异表达的circRNAs,其中47个显著差异,23个显著上调,24个显著下调。2)所有差异circRNAs的来源基因GO富集分析显示,共富集到生物过程336个、细胞组分59个和分子功能110个,主要与代谢过程、细胞膜结构和催化活性等相关,KEGG富集分析显示,富集到257条通路,主要与代谢(脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢和丙酸代谢)、胰高血糖素信号通路和AMPK信号通路等相关。3)circRNAs-miRNAs调控网络分析显示,627个差异circRNAs靶向结合187个miRNAs,组成了10602组调控关系。综上,本研究成功筛选了捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株间差异表达的circRNAs,对所有差异circRNAs的来源基因进行功能注释和富集分析,并构建了部分显著差异circRNAs-miRNAs调控网络。本研究结果为捻转血矛线虫耐药性产生的分子机制研究提供了新思路。