猪瘟病毒E2蛋白抗原单表位基因的融合表达及其免疫活性的研究

利用基因搭桥技术,在KlenowDNA聚合酶作用下,分别合成猪瘟病毒E2蛋白的3个抗原表位基因,并与原核表达载体pGEX-3X进行连接、转化和筛选鉴定,构建了3个重组质粒pGEX-C、pGEX-D和pGEX-E。在IPTG的诱导下,实现了可溶性蛋白的融合表达(GST-C、GST-D、GST-E),以GST亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。应用ELISA和Western-blot检测证实:E抗原表位基因表达的融合蛋白GST-E具有免疫学活性,而C和D的抗原表位基因虽然都表达了融合蛋白GST-C和GST-D,但未检测到免疫学活性。免疫攻毒保护试验表明:融合蛋白GST-E具有一定的免疫保护功能,为多表位疫苗的研究奠定了基础。

猪瘟病毒E2蛋白重复多表位基因的融合表达及其兔体免疫保护研究

目的 :研究猪瘟病毒 (CSFV)E2蛋白重复多抗原表位基因的融合表达及其免疫攻毒保护作用。方法 :应用PCR方法扩增猪瘟病毒E2蛋白重复多抗原表位基因 ,构建重复多表位基因的原核重组表达质粒PGEX-3E ,进行融合蛋白的表达和纯化。ELISA和Westernblot方法测定单表位融合蛋白GST-E和多表位融合蛋白GST-3E与猪抗CSFV的阳性血清和兔抗E2阳性血清的反应性 ,并进行融合蛋白的兔体免疫及免疫攻毒保护的比较研究。结果 :分子克隆和构建了原核重组表达质粒pGEX-3E ,表达和纯化了融合蛋白GST-3E ;单表位融合蛋白与重复多表位融合蛋白均能够与猪抗CSFV的阳性血清反应和兔抗E2的阳性血清产生免疫反应。在刺激兔体产生抗体方面 ,单表位融合蛋白刺激兔体产生抗体的能力较弱 ,而多表位融合蛋白则能够使兔体产生高效价的抗体。接种 10 0MID50 剂量猪瘟兔化弱毒 (HCLV)进行的兔体免疫攻毒保护试验表明 ,空白对照组和载体蛋白GST免疫组无保护作用 ,单表位融合蛋白免疫组具有一定的免疫保护作用 ,而重复多表位融合蛋白免疫组则完全能够抵抗猪瘟病毒的攻击。结论 :猪瘟病毒E2蛋白重复多表位的融合表达具有免疫保护作用 。

牛病毒性腹泻病诊断方法的研究进展

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)也称牛病毒性腹泻一黏膜病病毒(Bovine viraldiarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV),在分类学上属黄病毒科(Flaviviridae),瘟病毒属(Pestivirus)BVDV 与属内的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)及羊边界病毒(Border disease virus,BDV),在血清学上有交叉反应,BVDV感染牛能引起多种临床症状,如高热、腹泻、流涎、停食、白细胞减少、免疫抑制、粘膜充血等,还能引起奶牛产奶量下降,孕牛流产、产死胎及牛的持续性感染.

猪流感复合多表位核酸疫苗的构建及其表达研究

目的构建猪流感病毒复合多表位核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。方法以H3、H9亚型流感的HA抗原表位及流感病毒的其它主要抗原(NP、NA、M)表位基因为基础,再附以Kozak序列和适当的酶切位点,设计并合成一段长765bp的复合多表位基因(Epi),其中各表位基本独立,将其克隆入真核表达载体pIRES1neo,构建重组质粒pIRE-Epi。将多表位抗原基因Epi插入到融合表达基因H57中,构建重组质粒pIRE-H57-Epi。将构建的重组质粒在Hela细胞中表达,并用免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性。结果所构建的融合表达载体pIRE-Epi和pIRE-H57-Epi,在Hela细胞中表达出流感病毒多表位抗原蛋白,并具有抗原性。结论已成功构建猪流感病毒多表位基因,有可能成为较理想的猪流感候选疫苗。

尼帕病毒和亨得拉病毒核蛋白基因在杆状病毒表达系统的表达及反应原性鉴定

利用改造的昆虫杆状病毒表达系统转移载体，成功地对尼帕病毒（NiV）和亨得拉病毒（HeV）的核蛋白基因进行了分泌表达。重组蛋白表达的时效性分析结果显示，Sf9细胞感染重组病毒72～96h后，蛋白的表达量达到高峰，大规模表达可分别获得2．3～2．4mg／L纯化的目的蛋白。应用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光（IFA）对两种重组N蛋白与兔抗NiV和HeV阳性血清的反应性进行鉴定，结果表明两种重组N蛋白和阳性血清有很好的反应性，并且在血清学上有交叉反应。该研究为今后开展流行病学调查和诊断试剂的研制打下了基础。

新城疫病毒对肿瘤细胞生物学行为的影响

目的:研究新城疫病毒(NDV)对肿瘤细胞的作用。方法:采用空斑试验观察NDV对鸡胚成纤维细胞(CEF)的作用,通过细胞抑制试验、琼脂糖凝胶电泳、TUNEL染色、细胞骨架染色及细胞唾液酸含量测定等,观察NDV对肿瘤细胞的影响。结果:NDV对CEF、HeLa及Hep-2等肿瘤细胞可产生明显的病变,而对人的羊膜细胞(Wish细胞)无明显影响;对Hela细 胞和Hep-2细胞能产生明显的生长抑制作用,但无量效依赖关系。NDV还可导致以凋亡为主的细胞死亡,引起Hela细胞和Hep-2细胞的细胞骨架发生改变,以及去除肿瘤细胞表面唾液酸的作用。结论:NDV能选择性地作用于人肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞的生长,导致肿瘤细胞发生凋亡,有望成为一种有效的抗肿瘤生物制剂。

人免疫缺陷病毒I型 p24gag 基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。

A型H3579亚型流感多表位核酸疫苗小鼠实验免疫研究

目的为了应对流感流行多亚型并存的局面,进行了多表位核酸疫苗设计,并观察其免疫小鼠的细胞和体液免疫应答反应。方法设计并合成了含有H3、H9的HA和H5N1NA中和表位,M、NP基因保守序列CTL表位的多表位基因盒(Epi)。采用pVAX载体对H5HA、H7HA及Epi进行融合表达。经肌肉注射免疫6～8周龄雌性Balb/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中的针对H3579亚型流感抗体。三免后2周,分离脾淋巴细胞,进行T淋巴细胞转化试验和T淋巴细胞亚类数量检测。结果免疫小鼠获得了针对H3579亚型流感的体液和细胞免疫反应。结论完整HA抗原结合多表位的DNA疫苗模式的成功,预示了该DNA疫苗可能可以有效应对当前多种亚型流感并存的局面,并为其他种类流感疫苗的研究奠定了基础。

GFP转基因指示系统建立的研究

ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）是存在于发光水母体内的一种吸收蓝光或紫外光（３９５ｎｍ）后能够发出绿色荧光的天然蛋白质。本文报道了将ＧＦＰ表达质粒导入ＢＨＫ、ＤＫ、ＲＫ等真核细胞，建立ＧＦＰ真核细胞转基因指示系统。研究表明，ＧＦＰ在ＢＨＫ、ＤＫ、ＲＫ等传代细胞中表达的最佳条件是３３℃，ｐＨ７．２、５％ＣＯ２和转染后４８ｈ观察等。并对野生型ＧＦＰ和突变型ＧＦＰ的发光强度进行了比较，结果表明，在相同条件下。

斩断动物病毒病传播的“利剑”——我国动物病毒病防控工作还任重道远

动物病毒病防控是全球共同面临的难题,"重要动物病毒病防控关键技术研究与应用"项目解决了我国动物病毒病综合防控技术中的一些问题。但我国整体水平与国外还有一定的差距,仍需在动物病毒监测、跨种感染、致病机制、快速诊断试剂、新型疫苗研发和预警机制等方面加强体系建设,以提升我国动物疫病的综合防控能力。

GFP-p16融合基因表达载体在BHK HeLa细胞中荧光蛋白表达的研究

本文报道了通过脂质体转染技术将本室构建成的ＧＦＰ－ｐ１６融合基因表达载体ｐＣｐ１６Ｇ和ｐＣＧｐ１６分别导入ＢＨＫ、ＨｅＬａ细胞中，研究它们在真核细胞中荧光蛋白的表达。结果表明，外源脂质体对ＢＨＫ、ＨｅＬａ等真核细胞无损伤，经斑点杂交检测证明，外源基因可以通过脂质体转染技术整合到细胞基因组中。研究结果还表明，ｐ１６基因与ＧＦＰ基因的３′端连接，可以保持ＧＦＰ的荧光特性，表达荧光蛋白，而与ＧＦＰ基因的５′端连接，则不能表达荧光。

熊脑炎病毒的分离鉴定

用犬肾传代细胞从死亡幼熊脏器中分离到一株腺病毒,经细胞感染范围、动物感染试验、红细胞凝集试验、血清学试验及电镜和理化学性质等系统鉴定为Ⅰ型腺病毒.又称犬传染性肝炎病毒。

pIRVP3/pIRHNVP3核酸表达质粒的构建及对肿瘤细胞的影响

目的 研究应用凋亡素基因 (VP3)和NDVHN基因联合抗肿瘤的可能性。方法 以pIRES1neo为表达载体构建了含鸡贫血病毒VP3基因和长春株HN基因的pIRVP3/pIRHNVP32个核酸重组质粒。将 2个重组质粒在体外转染HeLa和OS 732细胞 ,用荧光显微镜、DNA琼脂糖电泳及TUNEL染色等方法 ,检测凋亡素基因和HN基因导致细胞死亡的类型。结果pIRVP3和pIRHNVP3转染HeLa和OS 732细胞 4 8h后 ,pIRVP3和pIRHNVP3均具有很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力 ,且pIRVP3的抗肿瘤作用强于pIRHNVP3。结论 在体外 。

抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析

目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点,构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。BglⅡ线性化后,电转化入受体酵母菌GS115中,筛选阳性重组子,进行甲醇诱导表达,并用RT-PCR、SDS-PAGE、双抗体夹心Dot-ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果:通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌,RT-PCR、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达,表达量可占培养液上清总蛋白量的18%,双抗体夹心Dot-ELISA法检测,表达产物能够特异识别重组HIV-1gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应,证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论:成功地实现了scFv基因的分泌性表达,为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。

DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达

目的利用塞姆利基森林病毒(SFV)复制子构建新型真核表达载体,并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下,连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中,构建新型真核表达载体pCS,再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中,构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞,进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示,重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24,并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达,且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性,为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。

犬IL-18 cDNA的克隆及其免疫学特性

目的 :获得犬白介素 18(cIL 18)基因并探讨其作为基因疫苗佐剂的免疫效果。方法 :从犬的外周血中分离白细胞 ,经ConA刺激培养 5～ 12h。提取犬白细胞总RNA作为模板 ,通过RT PCR技术扩增cIL 18cDNA。将其克隆到载体pMD18 T中测序 ,并与已发表的序列进行比较。将cIL 18cDNA克隆入pIRES1neo中 ,构建cIL 18真核表达载体。以 2 0 0 μg∶2 0 0 μg的比例 ,与狂犬病病毒糖蛋白表达载体pIGneo混合免疫犬 ,并与糖蛋白单独免疫犬的免疫应答进行比较。结果 :扩增获得单一长约 0 .6kb核酸带 ,测序证明长度为 5 82bp ,编码 193个氨基酸 ,与从犬肺巨噬细胞中扩增的cIL 18基因的序列完全一致。以构建的表达载体pIIL18与pIGneo混合免疫与用pIG neo单独免疫相比较 ,前者抗狂犬病病毒特异性抗体的水平显著低于后者 ;但混合免疫组犬外周血淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激的反应性显著高于糖蛋白单独免疫组。结论 :cIL 18全长为 5 82bp,其真核表达载体具有增强细胞免疫应答的能力 ,同时可显著抑制体液免疫应答。本研究为cIL

HIV多表位核酸疫苗构建及其免疫原性

目的设计新型HIV复合多表位疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效果。方法检索抗原表位数据库,进行新型HIV多表位核酸疫苗的设计,利用化学合成的方法合成多表位基因,并构建重组质粒pVAX1-MEGNp24,转染BHK-21细胞,间接免疫荧光法检测多表位基因的表达。重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体动态变化,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类。结果重组质粒pVAX1-MEGNp24经酶切及测序分析,证明构建正确。间接免疫荧光显示能在BHK-21细胞中表达多表位基因。免疫小鼠可诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫。结论已成功构建了重组质粒pVAX1-MEGNp24,小鼠免疫试验显示其具有良好的免疫原性。

鸡新城疫免疫防制的新认识

新城疫（ＮＤ）是极易传染的病毒性传染病，最常侵袭家鸡和珠鸡，也能感染许多其它家禽和野鸟。主要传播途径是呼吸道和消化道。目前大多数国家都采用预防接种作为控制新城疫的主要措施，但由于免疫程序的不同，使用疫苗的类型不同以及综合防制ＮＤ的观念上的差异，导致Ｎ...

腓肠神经营养血管皮瓣联合封闭式负压引流“三明治法”修复足踝部皮肤缺损

目的探讨腓肠神经营养血管皮瓣联合封闭式负压引流(vacuum sealing drainge,VSD)“三明治法”修复足踝部开放性皮肤缺损的临床疗效。方法对本院2009年9月至2020年3月接受以“三明治法”,即逆行腓肠神经营养血管皮瓣联合前后2次VSD敷料封闭负压引流术,修复足踝部开放性皮肤缺损并获得随访的13例患者的资料进行回顾性分析。其中男12例,女1例;年龄12~71岁,平均(34.3±2.0)岁;交通事故5例(轮辐伤3例,拖拉伤2例),重物砸伤4例,机器绞伤3例,爆炸伤1例,均出现骨质和(或)肌腱外露;开放性跟腱损伤3例,踝关节开放性骨折5例,足部开放性骨折4例,内踝骨质缺损1例。结果13例皮瓣术后全部成活。术后随访38~99个月,平均(77.2±3.0)个月,创面皮瓣均覆盖良好。按其外形、感觉、运动、疼痛及负重行走等进行下肢功能评价:优,外形美观,感觉功能恢复良好,无疼痛,对患足负重行走无影响;良,外形稍臃肿,能被患者接受,感觉功能部分恢复,无明显疼痛,患足负重行走功能尚可;可,外形臃肿,需二次整形,感觉功能恢复尚可,患处疼痛,对患足负重行走有一定影响;差,外形臃肿,需二次整形,感觉无恢复,患足疼痛,无法负重行走,需二次手术。13例患者中,10例优,皮瓣外观、血运、质地、弹性、色泽均良好;2例良,其中1例二次入院行皮瓣整形术,效果满意;1例可。结论腓肠神经营养血管皮瓣联合VSD“三明治法”治疗足踝部开放性皮肤缺损,通过一期VSD发挥清创、收缩创面作用,二期VSD起到充分引流、固定皮瓣和/或游离皮片、促进皮瓣愈合及血运重建的作用,可以达到较佳治疗效果,是一种安全有效的治疗足踝部开放性皮肤缺损的方法。

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。