持续低氧条件下大鼠肠道微生物变化及其与心肌损伤的关联研究

【目的】研究持续性常压低氧对大鼠肠道微生物的影响,并分析其与低氧性心肌肥厚的关联性。【方法】雌性无特异性病原体(specific-pathogen-free,SPF)级SD(Sprague-Dawley)大鼠,按随机数字表法分为2组:常氧组和低氧组。实验开始后,低氧组大鼠置于低氧舱中,氧气浓度设定为10%,持续暴露30 d,常氧组大鼠正常条件饲养。每天记录大鼠体重,并于低氧前(0 d)和低氧后(30 d)分别收集粪便进行16S rRNA基因扩增子测序,测定肠道微生物组的变化。实验结束后进行血常规、血生化和器官指数分析;采用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测右心室组织中4种分子标志物心房利钠肽基因(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽基因(brain natriuretic peptide,BNP)、心肌肌球蛋白重链6基因(myosin heavy chain 6,Myh6)、心肌肌球蛋白重链7基因(myosin heavy chain 7,Myh7)的mRNA表达;并在肠道微生物组和各类指标之间进行Spearman关联分析。【结果】低氧大鼠体重降低,红细胞数量、红细胞比容、血红蛋白浓度均明显升高。低氧大鼠右心指数显著升高,血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性增高,BNP和Myh7的表达显著升高而Myh6的表达降低,表明低氧导致大鼠心肌损伤并发生了右心室病理性肥厚。低氧改变了大鼠肠道微生物的α多样性和β多样性;线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析结果提示常氧组大鼠的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)相对丰度较高,而低氧组大鼠的乳酸杆菌科(Lactobacilliaceae)和乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度较高。LDH与摩根菌属(Monoglobus)和帕鲁迪杆菌(Papillibacter)正相关,与苜蓿科(Defluviitaleaceae_UCG-011)负相关;CK与菌株RF39正相关;Myh6的表达量与Prevotellaceae_NK3B31_group和幽门螺杆菌(Helicobacter)正相关;BNP的表达量与瘤胃球菌科(Ruminococcaceae_UCG_009)正相关。【结论】持续性低氧显著改变了大鼠肠道微生物的丰富度、均匀度和菌群结构;该变化与心肌损伤指标之间存在显著相关性,表明肠道菌群可能在低氧性心肌肥厚中发挥重要作用。

lncRNA XLOC006926抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

目的探讨lnc RNA XLOC006926调控肝癌细胞增殖和转移机制,结合肝癌患者临床病理特征,分析其临床意义。方法利用实时荧光定量PCR方法检测lnc RNA XLOC006926在肝癌细胞系及肝癌患者配对(癌、癌旁)组织(n=88)中的表达水平。进一步通过CCK-8、克隆形成、划痕及transwell实验检测过表达或抑制lnc RNA XLOC006926对细胞增殖、迁移和侵袭的影响,同时结合临床信息统计分析其与临床病理特征及患者预后的相关性。结果 lnc RNA XLOC006926在肝癌细胞及肝癌组织中的表达显著降低,过表达lnc RNA XLOC006926后肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力降低,相反抑制lnc RNA XLOC006926后肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力增强。结合患者临床信息分析,lnc RNA XLOC006926的表达量与肿瘤大小(P=0.007)、PVTT(P=0.024)具有显著相关性,其低表达预示着预后较差。结论 lnc RNA XLOC006926在肝癌发生发展中发挥了重要作用,参与调节肝癌细胞的增殖及迁移,有望成为肝癌发生发展的生物标志物和肝癌预防治疗的新靶点。

结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究

目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA候选疫苗株并鉴定,初步评价其免疫原性。方法从GenBank中获取M.tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列优化后合成,经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,构建重组质粒PVAX1-Hsp65-Ag85B和PVAX1-Hsp65-ESAT6。重组质粒体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答反应。结果Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株在体内外均能表达,Western blot结果显示,DNA疫苗株体外转染293T细胞,24 h可检测到特异性蛋白条带,48 h蛋白表达量达最高。小鼠体内实验表明,Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均可激发较强的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答,且Hsp65-Ag85B优于Hsp65-ESAT6。结论Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答,推测Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力优于Hsp65-ESAT6,为新型结核DNA疫苗研制提供了实验依据。

表达CTLA4抗体的重组流感病毒构建及溶瘤效果研究

目的拯救表达免疫检查点CTLA4抗体的重组流感病毒,全面鉴定并体内外实验评价其溶瘤效果。方法利用流感病毒反向遗传学(reverse genetics,RG)技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)为载体,分别在PR8病毒PB1和PA基因片段插入免疫检查点CTLA4抗体的重链和轻链构建重组质粒pFlu-CTLA4-PB1、pFlu-CTLA4-PA,与PR8病毒的其余6个质粒pHW191-PB2、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS共转染COS-Ⅰ和MDCK细胞,经拯救、筛选、鉴定获得重组溶瘤流感病毒,命名为rFlu-muCTLA4。通过血凝试验、EID_(50)、PCR等方法全面鉴定;ELISA测定anti-CTLA4抗体含量;3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5(MTS)细胞活力测定重组病毒对小鼠肝癌H22细胞的杀伤效果;利用小鼠肝癌模型,评价重组病毒在体内对肿瘤的抑制效果。结果 rFlu-muCTLA4的血凝效价为2~9～2^(10),且能够在鸡胚中稳定传代;EID_(50)为10^(-8)EID_(50)/ml;重组病毒的PB1、PA片段与预期大小一致;重组病毒接种鸡胚培养2 d可检测到anti-CTLA4抗体,4天达到高峰值。MTS结果显示,rFlu-muCTLA4能特异性杀伤H22细胞活力,呈现剂量依赖性。动物实验表明,重组病毒能显著减小小鼠肝癌肿瘤体积,提高动物存活率并延长存活时间。结论表达免疫检查点CTLA4抗体的重组流感病毒rFlu-muCTLA4在体内外能靶向杀伤肝癌细胞,有望为溶瘤病毒靶向治疗肝癌提供新的思路。

HIV-1整合位点分布机制及检测的研究进展

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)引起的慢性传染性疾病,对人类的生命健康构成了严重威胁.整合是HIV-1病毒复制生命周期的关键环节,不同于新冠病毒等非整合型病毒,HIV-1自身基因编码的逆转录酶和整合酶,可帮助病毒整合入宿主细胞基因组,同步复制,确保病毒的遗传信息长期存在于宿主细胞中.然而HIV-1整合位点的选择不是随机的,而是与染色体结构和宿主基因功能等紧密相关.本文综述了有关HIV-1整合位点的检测方法、分布特征及影响其选择的因素等方面的研究进展,旨在为艾滋病的精准防控、治疗,乃至最终治愈提供信息参考.

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染小鼠致肺炎的模型构建与特征分析

目的建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的BALB/c小鼠吸入感染肺炎恢复模型,并评价模型的病原学、病理学、免疫学特征。方法将MRSA以气溶胶肺递送途径感染小鼠,在7 d内观察小鼠状态与死亡情况。选择亚致死剂量构建小鼠肺炎恢复模型,检测感染后小鼠的血液及心、肝、脾、肺、肾组织中的细菌载量及病理变化,并对血清与肺泡灌洗液中的细胞因子及肺组织的重要细胞群的变化趋势进行检测。结果致死剂量感染后小鼠的死亡时间集中在48 h内。亚致死剂量感染小鼠后,肺部的病变以48~72 h最为严重,其余组织器官无严重病变;多种细胞因子在12~48 h浓度升高至峰值,在96 h下降至接近感染前水平;在感染后48 h内的肺中,中性粒细胞、树突状细胞、炎性单核细胞、间质巨噬细胞和内皮细胞的比例明显增加,而T细胞、B细胞、肺泡巨噬细胞和上皮细胞的比例则下降。大部分细胞群的比例在96 h恢复至接近感染前水平。结论本研究成功构建了小鼠吸入MRSA感染肺炎恢复模型,并通过多种指标的检测明确0~96 h是小鼠感染后的应答关键期。该小鼠模型可用于深入开展MRSA感染的发病机理、免疫调控、治疗评价等研究,具有良好的应用价值。

大流量湿壁气旋式生物气溶胶采样器的设计及其性能评价

目的对自行设计的一种大流量湿壁气旋式生物气溶胶采样器进行性能标定。方法使用多分散的NaCl气溶胶评价物理采样效率,使用黏质沙雷菌及大肠埃希菌噬菌体PhiX174气溶胶评价生物采样效率,使用过氧化氢消毒剂进行清洗消毒效果评价,在实际环境中评价湿壁气旋气溶胶采样器的实际采样性能。结果湿壁气旋式生物气溶胶采样器的物理切割粒径为1μm。湿壁气旋式生物采样器对黏质沙雷菌气溶胶及大肠埃希菌噬菌体PhiX174的总生物采样效率分别为(25.47±12.94)%及(16.34±1.67)%,活性生物采样效率分别为(42.98±6.53)%和(24.24±6.68)%。消毒清洗功能能够清除采样器气旋室内(99.73±0.04)%的核酸及>99.99%的活菌。现场气溶胶采样结果显示湿壁气旋气溶胶采样器生物气溶胶检出限比AGI-30降低约40倍,计算得到的空气微生物浓度比BioStage高约7倍。结论该大流量湿壁气旋式生物气溶胶采样器能够在单位时间内采集更多的空气,有更高的富集比和较低的生物粒子检出限。

大气PM2.5对大鼠心肌细胞的毒性作用

为评估大气PM_(2.5)及其不同组分对心肌细胞H9C2的毒性作用,探讨PM_(2.5)对心血管系统产生毒性作用的关键组分,将前期采集并制备的PM_(2.5)完全颗粒物、PM_(2.5)水溶性组分、PM_(2.5)脂溶性组分和PM_(2.5)单纯颗粒物以不同质量浓度对H9C2细胞染毒.用MTS法在染毒6、10、24、48、72 h后测定细胞活力;根据细胞活力测定结果,选用较低染毒浓度(10μg/m L),用相关试剂盒测定染毒24 h后胞内和上清液中LDH(乳酸脱氢酶)和SOD(超氧化物歧化酶)活力,ELISA及RT-q PCR法测定炎性因子IL-6和TNF-α表达量,AP位点计数法测定细胞DNA损伤情况.结果表明:颗粒物成分(PM_(2.5)完全颗粒物和PM_(2.5)单纯颗粒物)对H9C2细胞表现出强烈的生长抑制作用,50μg/m L及以上染毒浓度组在染毒时间≥24 h时细胞可能已经全部死亡,而可溶性成分(PM_(2.5)水溶性组分和PM_(2.5)脂溶性组分)对H9C2细胞生长表现为极弱或无生长抑制作用,仅400μg/m L的PM_(2.5)脂溶性组分始终对细胞生长表现出抑制作用;各组分样本都在一定程度上造成了H9C2细胞损伤,降低了胞内LDH和SOD活性;PM_(2.5)完全颗粒物和PM_(2.5)脂溶性组分在造成炎性损伤方面的作用较为明显.研究显示,颗粒物组分对H9C2细胞致死作用显著,相对而言,PM_(2.5)完全颗粒物表现出的毒性作用最强且最全面.

一种共用线阵探测器的双M型C-T光谱仪

现有的切尼特纳光谱仪实现双波段或多波段探测时往往结构复杂,设计成本高,而以线阵探测器接收信号的光谱仪又很少用于多波段探测。本文在传统的切尼特纳光谱仪的基础上,设计了一种共用线阵探测器的双M型切尼特纳光谱仪,用于双激光诱导荧光光谱的探测。该光谱仪采用线阵光电倍增管作为探测器,可以实现280~460 nm和380~560 nm两个波段光谱的快速探测。采用发散光照射光栅的方法校正像面光斑在色散方向上的宽度,从而实现对光谱仪像散的控制。利用光学设计软件对系统光路结构进行仿真优化,对系统的线色散率和RMS光斑进行理论分析,并在原理样机中进行了实验验证。结果表明,两个波段平均光谱分辨率分别为5.84 nm、6.15 nm。本文提出的光谱仪不仅适用于双激光诱导荧光光谱应用,在其他双通道光谱探测领域中也具有很大的应用前景。

我国HIV流行毒株分离培养与标准株筛选鉴定

目的通过对我国人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者全血样本中的HIV进行分离培养与基因型、表型鉴定,筛选符合中华预防医学会团体标准《病原微生物菌(毒)种标准株艾滋病病毒毒株建立技术规范》(T/CPMA 027—2023)评价要求的HIV标准株。方法收集48份HIV感染者全血样本;通过分离样本中的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),并将其与健康人全血样本中分离得到的PBMCs共培养分离感染者体内的HIV,测定培养上清液中的p24抗原浓度和病毒滴度;对于分离成功的毒株,提取病毒RNA,对gag、pol基因和env C2V3片段进行扩增测序,判断基因型、基因重组和耐药位点;通过将病毒培养上清液接种到表达CCR5或CXCR4的Ghost细胞,判断病毒嗜性;通过将病毒培养上清液接种MT-2细胞,观察合胞体的形成。结果从48份HIV感染者的新鲜EDTA抗凝全血中分离培养出14株病毒培养上清液的p24抗原浓度>1 ng/ml的HIV毒株;1株病毒滴度≥10^(5)TCID_(50)/ml,8株滴度≥10^(4)TCID_(50)/ml,5株滴度≥10^(3)TCID_(50)/ml;其基因型为9株B亚型、3株CRF01AE重组型和2株CRF07BC重组型;14株HIV毒株中11株含有耐药位点;细胞嗜性分析结果显示其中8株为CCR5嗜性,6株为CXCR4/CCR5双嗜性;14株毒株中只有2株可引起MT-2细胞病变,为合胞体诱导型。结论本研究共分离出14株具有HIV典型生物学、遗传学特性的HIV毒株,经评价1株为符合《病原微生物菌(毒)种标准株艾滋病病毒毒株建立技术规范》(T/CPMA 027—2023)的HIV标准株。本研究可为HIV-1标准株的筛选提供技术指导。下一步可按照标准株的共享机制完成申请及储备库建设,为HIV疫苗与药物研发等相关研究提供资源。

蜱传脑炎病毒跨过血脑屏障的体外实验

【目的】构建蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)跨血脑屏障研究的体外细胞模型,研究2种不同细胞的TBEV培养物在病毒跨过血脑屏障中的主要差异,从而为进一步TBEV跨血脑屏障的分子机制研究奠定基础。【方法】利用人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,hCMEC/D3)构建体外血脑屏障的细胞模型。用BHK-21细胞中培养的蜱传脑炎病毒感染人脑微血管内皮细胞,检测TBEV在hCMEC/D3中的复制增殖情况;将TBEV加入体外血脑屏障模型的上层微孔中,用实时荧光定量PCR和噬斑测定的方法检测跨过血脑屏障的病毒量;将感染TBEV的人单核细胞加入血脑屏障模型的上层微孔中,观察渗漏进下层孔中的淋巴细胞,并用实时荧光定量PCR和噬斑测定的方法检测跨过血脑屏障的病毒量。利用伊文思蓝标记的白蛋白确定血脑屏障细胞的渗透率变化。【结果】实时荧光定量PCR和病毒滴度测定结果表明,TBEV不能在hCMEC/D3细胞中复制增殖,也不能直接跨过血脑屏障;然而,人单核细胞THP-1感染TBEV后,尽管单核细胞不能直接携带TBEV跨过血脑屏障,但THP-1中产生的病毒却能跨过血脑屏障模型进入下层孔中,并引起血脑屏障渗透率的增高。【结论】单核细胞有助于TBEV跨过血脑屏障。

CRF01_AE/CRF07_BC重组毒株近似全长基因组序列和系统进化分析

目的鉴定我国深圳地区人类免疫缺陷病毒-Ⅰ型(HIV-1)新型二代毒株(CRF01_AE/CRF07_BC),了解重组毒株的流行特征及新型重组模式。方法对深圳市2011-2016年新确诊的未接受抗逆转录病毒治疗的HIV-1感染者血浆样本进行近似全长基因组扩增和测序,选取第一代重组毒株作为母本的第二代独特重组毒株作为研究对象;获得的近似全长基因组序列使用Quality Control工具进行质量检测和基因型初步分析,基于近似全长序列使用最大似然法构建系统进化树;随后使用jpHMM和RIP工具进行重组断点分析,并构建Neighbor-Joining系统进化树验证重组断点,并对来自不同母本的重组片段进行同源性分析。结果从我国深圳地区HIV-1感染者中发现了两种新型二代独特重组毒株(CRF01_AE/CRF07_BC):LS13810和LS4017并获得其近似全长基因组序列;其中LS13810近似全长基因组以CRF01_AE为骨架,分别在病毒的pol和tat区插入两个来自于CRF07_BC的片段;而LS4017近似全长基因组的5′半分子来源于CRF07_BC,而3′半分子主要来源于CRF01_AE,3′半分子的gp120区插入了部分CRF07_BC片段。结论深圳市已经出现了完全由一代重组毒株重组形成的第二代独特重组毒株,重组毒株正在向更加复杂的形式演变,当地乃至我国均亟需建立能准确监测重组毒株发生和流行情况的分子监测策略,以应对毒株重组模式变化和重组毒株流行为HIV-1感染的精准防控和诊断、治疗带来的挑战。

2020-2021年河北省新诊断HIV-1感染者中和抗体分布状况

目的了解河北省2020-2021年新诊断HIV-1感染者不同人群中和抗体分布特征及潜在的影响因素。方法收集河北省2020年-2021年新诊断的HIV-1感染者血浆共500份,中和实验筛查感染者血浆中和抗体分布,PCR扩增和测序获得感染者体内毒株env基因序列,分析gp120的V1V2区、V3区和gp41基因氨基酸序列长度及非同义突变与同义突变的比例(dN/dS)所体现的选择压力与感染者血浆中和广度的相关性。结果相较于异性恋感染者,男男同性恋感染者群体中和抗体滴度更高,异性恋感染者群体中,男性感染者的中和抗体滴度高于女性感染者;CRF01_AE和BC重组型感染者血浆样本对同亚型假病毒表现出更强的中和活性(P均<0.05),而单纯B亚型和C亚型毒株感染者血浆样本对同亚型假病毒或不同亚型假病毒的中和活性均无统计学差异;gp120的V1V2区的氨基酸序列长度及体现选择压力的dN/dS均与中和抗体的中和广度线性相关。结论HIV-1感染者体内中和抗体在不同传播人群分布存在差异,男男同性恋感染者人群比异性恋人群具有更高的中和活性,重组型感染者血浆展现出对同亚型假病毒的中和优势;且中和抗体的中和广度与病毒gp120高变区的氨基酸长度及宿主的选择压力密切相关。

microRNAs与流感病毒感染

MicroRNAs是一类数目庞大,而且可以广泛参与到生命活动各个进程的非编码RNA分子,在病毒感染宿主过程中存在着复杂的microRNAs与病毒的相互作用。流感病毒感染可以引起宿主microRNAs表达谱的明显变化,流感病毒能通过调控某些microRNAs的表达来实现免疫逃逸等增强其感染能力;同时,宿主也可以通过某些microRNAs的变化启动相应的抗流感病毒反应。本文主要针对流感病毒感染过程中宿主-病毒二者在microRNA水平的相互作用进行综述,以期更好的了解流感病毒的致病机制,为抗流感病毒的新药研制提供新的思路。