RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰:旧貌新颜

细胞内存在多种类型的RNA分子,在调控细胞进程中各自发挥着重要的作用。RNA修饰是在RNA分子上添加化学基团,修饰基团可以改变RNA稳定性、结构和功能,RNA修饰使RNA的功能和作用具有多样性。在氧化应激条件下,8-羟基鸟嘌呤是一种标志性的RNA氧化修饰形式。RNA的结构与功能都可能会受到8-羟基鸟嘌呤修饰的影响,RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰发生可以通过诱导RNA链断裂、碱基脱落等方式影响RNA的结构与功能。研究表明,RNA中8-羟基鸟嘌呤修饰水平可以作为疾病发展的评估指标。随着RNA修饰研究的深入,对RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰的研究也日益受到重视。本文主要对RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰的生成、RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰的生物学功能、RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰修复调控相关蛋白质分子、8-羟基鸟嘌呤修饰RNA分子检测技术,以及RNA 8-羟基鸟嘌呤与神经性疾病和癌症等疾病的关系研究进展进行综述,旨在为RNA修饰的生物学功能和8-羟基鸟嘌呤修饰RNA在疾病中的潜在作用研究提供思路和启示。

人脐带间充质干细胞复合胶原支架治疗小型猪皮肤缺损的实验研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)复合胶原支架用于小型猪全层皮肤缺损修复的治疗作用。方法在小型猪背部沿正中线两侧切取正方形全层皮肤缺损创面,随机分为两组,每组6个创面,分别给予胶原支架(对照组)及hUC-MSCs复合胶原支架(实验组)治疗。术后连续监测实验动物的生理状况及创面愈合情况,分别于治疗3周及6周切取创面组织进行HE染色,评估创面皮肤损伤修复效果;并通过CK14及Ki67免疫组织化学染色,评估治疗3周后表皮层细胞增殖情况。结果实验组治疗3周后皮肤创面愈合率[(91.25±3.58)%]明显高于对照组[(73.79±5.73)%](P<0.05)。组织学检测结果表明,实验组治疗3周后创面再表皮化速度较对照组显著提高;治疗6周后,实验组新生表皮层结构较对照组完整且厚度均一,并可见类似正常皮肤的表皮钉突及真皮乳头结构。免疫组织化学分析显示,治疗3周后,实验组表皮层细胞CK14呈强阳性表达;实验组表皮基底层细胞Ki67阳性率[(35.03±6.46)%]较对照组[(2.07±1.07)%]显著提高(P<0.01),表明实验组表皮层细胞增殖活跃。结论hUCMSCs复合胶原支架能显著促进小型猪全层皮肤缺损再表皮化,提高创面愈合速度,为后续开展临床应用研究奠定了基础。

生长停滞特异性基因6对成骨前体细胞辐射损伤后增殖作用的研究

目的研究生长停滞特异性基因6(growth arrest-specific gene 6,gas6)在成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)辐射损伤后凋亡及增殖中的作用。方法体外建立MC3T3-E1细胞辐照损伤模型,通过流式细胞术检测辐照对该细胞凋亡和增殖的影响;通过qRT-PCR和ELISA方法检测该细胞在辐照后gas6基因表达及蛋白分泌变化;使用gas6小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对MC3T3-E1辐照损伤模型进行处理,通过BrdU掺入实验结合流式细胞术分析其对该细胞增殖的影响;使用AXL抑制剂R428对其辐照损伤模型进行处理,通过BrdU掺入实验检测GAS6作用受体阻断后对该细胞增殖的影响,以探究潜在的分子机制。结果成功建立MC3T3-E1辐照损伤模型,流式分析结果表明,9 Gyγ射线照射能引起MC3T3-E1的凋亡;qRT-PCR以及ELISA实验结果显示,9 Gyγ射线照射导致其gas6基因表达及蛋白分泌显著增加;流式分析结果表明,gas6的沉默表达会显著抑制辐照损伤的MC3T3-E1的增殖,AXL受体抑制剂R428能显著抑制辐射损伤MC3T3-E1的增殖,提示GAS6/AXL轴在MC3T3-E1辐射损伤再生中发挥正性调控作用。结论GAS6具有促进MC3T3-E1辐射损伤后再生的作用。

MiR-125b-1-3p在轮状病毒复制中的作用研究

目的研究miR-125b-1-3p在轮状病毒(rotavirus)复制过程中的作用和调控机制。方法将MA104细胞中的miR-125b-1-3p分别上调和下调后感染轮状病毒,通过RT-PCR分析miR-125b-1-3p的表达情况和轮状病毒拷贝数;免疫荧光分析miR-125b-1-3p对轮状病毒蛋白表达情况的影响;Western blot分析miR-125b-1-3p参与调控的相关蛋白表达情况。结果轮状病毒感染细胞后,miR-125b-1-3p的表达水平明显上调,上调miR-125b-1-3p后,轮状病毒的VP7、NSP3基因拷贝数下降,下调miR-125b-1-3p后,轮状病毒的VP7、NSP3基因拷贝数明显升高;上调miR-125b-1-3p的表达水平后轮状病毒蛋白荧光数下降,下调miR-125b-1-3p后,病毒蛋白荧光数增加;轮状病毒感染细胞16 h后PI3K/Akt通路活性受到抑制,上调miR-125b-1-3p能够抑制PI3K/Akt通路的活化。结论miR-125b-1-3p通过调控PI3K/Akt通路抑制轮状病毒的复制。研究结果为探讨miR-125b-1-3p和PI3K/Akt通路之间的具体调控机制研究提供了实验基础,为轮状病毒抗感染治疗提供了靶点。

丝氨酸代谢在脐带血红系细胞增殖过程中的作用研究

目的通过探索氨基酸代谢对红系细胞体外扩增的影响,为提高脐带血红系细胞体外扩增的效率以制备大量的红系细胞奠定基础。方法高效液相色谱法(HPLC)测定脐血单个核细胞(MNC)中造血细胞向红系细胞分化及增殖过程中培养基内氨基酸的消耗情况,筛选出消耗多的氨基酸;进一步选择人脐带血来源的红系祖细胞系(HUDEP-2)作为研究对象,对其培养体系进行特定氨基酸的缺乏与补加,通过细胞计数、EdU掺入实验结合流式细胞术等方法分析特定氨基酸在红系细胞扩增过程中的作用;向红系培养体系中添加特定氨基酸代谢的抑制剂,进一步评价该氨基酸代谢在红系细胞扩增过程中的作用。结果HPLC法检测发现,红系细胞定向分化及增殖过程中丝氨酸的消耗最为显著。在缺乏丝氨酸的培养体系中,红系祖细胞系HUDEP-2的增殖与存活受到明显抑制,但丝氨酸的缺乏并不影响HUDEP-2细胞表面红系细胞特征蛋白的表达。向红系培养基中添加丝氨酸分解代谢的关键酶抑制剂——丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)抑制剂SHIN1后,发现SHIN1明显抑制HUDEP-2的增殖与存活。结论丝氨酸是维持红系细胞增殖能力的关键氨基酸,其分解代谢产生的一碳单位可能是红系细胞增殖所必需的,该结果为体外进一步提高脐带血红系细胞的扩增效率提供了实验依据。

Ad(E1-).sT治疗乳腺癌移植瘤的作用及体内免疫激活效应

目的研究复制缺陷型腺病毒Ad(E1-).s T治疗小鼠乳腺癌移植瘤的作用,探讨Ad(E1-).sT的免疫激活效应。方法指数生长期的小鼠乳腺癌细胞4T1按2×10~6细胞/100μl PBS皮下荷瘤4～6周龄的BALB/c小鼠,建立具有完全免疫系统的乳腺癌移植瘤模型。荷瘤后第7天,将成瘤小鼠分为Buffer治疗组、Ad(E1-).Null治疗组和Ad(E1-).s T治疗组,分别瘤内给予PBS、Ad(E1-).Null和Ad(E1-).s T(2.5×10^(10) VPs/小鼠)进行治疗;第10天,重复治疗一次。于第7、12、15、19天,分别测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,于第12、18天,内眦静脉取血,检测小鼠血象和外周血T淋巴细胞亚型;于第19天处死小鼠,剥离肿瘤,测定肿瘤重量,并分离脾脏细胞,测定树突状细胞(DCs)的比例和数量。结果 Ad(E1-).s T治疗能够有效抑制乳腺癌移植瘤的生长,抑制肿瘤重量的增加。在机制上,Ad(E1-).s T能够调节小鼠外周血的血象,抑制淋巴细胞、粒细胞和中间细胞的增长;同时,Ad(E1-).s T能够促进T淋巴细胞的成熟和分化,降低未成熟淋巴细胞的比例,促进CD4^+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的增殖。此外,Ad(E1-).s T还增强小鼠脾脏DCs的扩增与成熟。结论 Ad(E1-).s T可通过调节机体抗肿瘤免疫反应,抑制乳腺癌移植瘤的生长。

逆转录病毒介导的稳定表达E4orf1和绿色荧光蛋白的胎肝窦内皮细胞株的建立

目的:为构建优化的内皮细胞用于造血干细胞(HSCs)的支持培养,通过逆转录病毒载体系统建立稳定表达腺病毒E4区开放读框1(E4orf1)和绿色荧光蛋白(GFP)的人胎肝窦内皮细胞(HFLSECs)株。方法:利用Plat-A细胞将质粒MSCV-N E4orf1和p MX-GFP分别包装为逆转录病毒,共同感染HFLSECs,将原代培养的HFLSECs和转基因的HFLSECs分别在含有0.5、1、2、4μg/m L嘌呤霉素的EGM-2培养基中培养,以测试最适药物筛选浓度,药筛1周后通过流式细胞分选获得稳定转染E4orf1的GFP^+HFLSECs(E4orf1-GFP/HFLSECs)。通过密度梯度离心法从脐带血中分离单个核细胞,利用免疫磁柱分选获得CD34^+造血干/祖细胞(HSPCs),以E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层联合SCF、TPO、Flt-3L等3种基础造血相关因子进行体外扩增和半固体造血细胞集落培养。结果:0.5μg/m L嘌呤霉素在5 d内即能完全杀死HFLSECs,而转基因的HFLSECs可以正常存活,以此药物浓度加压筛选1周,后续通过流式分选GFP阳性细胞,阳性率为90.5%,在E4orf1-GFP/HFLSECs饲养层支持下,人脐带血来源的CD34^+细胞15 d扩增了360倍,是单纯细胞因子悬浮培养组的2.2倍,且扩增后的HSPCs在体外仍具有多种造血集落形成能力。结论:该细胞株的建立将为构建造血干细胞体外培养体系及研究造血细胞的发育分化提供适宜的微环境。

敲低微小染色体维持蛋白7对肝癌细胞生物学功能的影响

目的研究微小染色体维持蛋白7(MCM7)在肝癌细胞中的功能及作用机制,建立MCM7低表达的肝癌细胞株。方法构建MCM7基因的p SicoR慢病毒干扰载体,对上述载体进行XbaⅠ和XhoⅠ双酶切和测序鉴定。鉴定正确后,在HEK293T细胞中进行慢病毒包装,并使用40%PEG浓缩后的慢病毒感染肝癌细胞,通过流式细胞术分选得到绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞,扩增后收集细胞进行Western印迹鉴定;利用CCK-8、克隆形成、三维培养、凋亡检测以及细胞迁移实验初探MCM7敲低对肝癌细胞生物学功能的影响。结果双酶切和测序结果表明,p SicoR-shMCM7-GFP质粒构建成功; Western印迹结果表明,MCM7的表达水平在分选后的稳转肝癌细胞株中明显下调;对稳转细胞株的生物学功能进行分析,发现在体外敲低MCM7能抑制肝癌细胞的增殖及迁移能力并促进细胞凋亡。结论敲低MCM7的表达对肝癌细胞的增殖和迁移能力有一定的抑制作用并促进细胞凋亡。

脐带间充质干细胞来源的外泌体有效扩增脐带血CD34^(+)细胞

目的 探讨脐带间充质干细胞外泌体(MSC-Exo)在脐带血CD34^(+)细胞扩增中的作用。方法 采用差速离心法从人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)培养上清中分离提取外泌体,透射电镜观察其形态特征,并采用纳米颗粒跟踪分析技术进行鉴定。利用免疫磁珠分选法从新鲜脐带血中分离获得CD34^(+)造血干/祖细胞(HSPC),接种到24孔板中,在含有干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等细胞因子的StemSpan无血清培养基中,实验组加50μg/ml外泌体,对照组加等体积PBS,分别在培养第6和12天,对HSPC扩增数量计数并进行统计分析;利用流式细胞仪检测2种培养条件下HSPC表面标志的表达情况,并于集落培养12 d后进行造血集落形成实验。结果 脐带血CD34^(+)细胞在培养扩增12 d,实验组细胞扩增数量是对照组的1.88倍,两者差异显著(P<0.01);进一步分析表明,培养至第6和12天,实验组中原始造血干细胞(pHSC)(CD34^(+)CD38^(-)CD90^(+)CD45RA-CD49f^(+))的数量分别是对照组的2.13和3.17倍,差异具有统计学意义(P<0.05);造血集落形成实验显示,集落培养12 d,实验组细胞形成的造血集落数量显著高于对照组,特别是代表原始造血分化潜能的混合系集落形成单位(CFU-GEMM)数量显著提高,是对照组的1.9倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 添加脐带MSC-Exo的无血清培养体系,对HSPC的扩增具有更强的促进能力,并能有效提高扩增产物中pHSC的比例。

RUNX1c及GATA2表达质粒构建及其在肝细胞中表达的鉴定

目的构建含RUNX1c及GATA2基因的表达质粒,探讨水动力转染法能否实现其在小鼠肝中的表达。方法采用PCR方法分别扩增RUNX1c及GATA2基因序列,并分别连入T载体中,通过双酶切、连接反应将2个基因序列分别连入慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中。将含RUNX1c及GATA2基因的慢病毒毒液转染至L-02细胞,通过qPCR方法检测目的基因表达。通过水动力高压转染方法将此两种质粒通过尾静脉注入小鼠体内,于转染24 h,取小鼠肝组织,对组织切片进行抗RUNX1及GATA2抗体的免疫荧光染色;于转染72 h,通过流式细胞术分选肝组织中GFP+细胞,实时定量PCR(qPCR)检测RUNX1c、GATA2及造血相关基因的表达。结果经双酶切及测序鉴定证明,pCDH-MCS-T2A-RUNX1c-copGFP-MSCV、pCDH-MCS-T2A-GATA2-copGFP-MSCV质粒构建成功。通过体外实验证实这两个载体携带的RUNX1c及GATA2基因能在人肝细胞系L-02中表达。水动力高压转染法可使含RUNX1c及GATA2的质粒进入肝组织,并在肝细胞中表达RUNX1及GATA2蛋白。通过分选肝组织中GFP+细胞,可发现这些细胞内过表达RUNX1及GATA2基因,Fli-1、Erg基因的表达也明显提高。结论成功构建了含有造血转录因子RUNX1c、GATA2基因的表达载体,并通过水动力转染法实现RUNX1c、GATA2的表达载体在小鼠肝中的表达,为进一步研究肝中过表达造血转录因子能否实现肝细胞转分化为造血细胞及观察其对造血系统修复的作用奠定基础。