联合应用凋亡素基因、新城疫病毒HN基因及IL-18基因对黑色素瘤的抑制效应研究

以前的研究结果表明，来自于鸡贫血病毒的凋亡素基因、来自于鸡新城疫病毒的HN基因和IL-18基因具有不同的抗肿瘤效应，但上述基因抗肿瘤的机制不同，本研究在双启动子真核表达质粒pIRES中的CMV启动子下游插入凋亡素基因，IRES启动子下游插入IL-18HN嵌合基因，构建能同时表达三种基因的真核表达质粒pIRVP3IL-18HN。复制C57BL／6小鼠荷黑色素瘤模型，并将质脂体包裹的重组质粒进行瘤内注射，共注射3次，每次100μg质粒，拟观察凋亡素、新城疫病毒HN基因和IL-18基因以核酸疫苗的形式联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应。结果显示pVIL-18HN、pVlL-18和pVVP3IL-18均有抑制肿瘤作用，但pIRVP3IL-18HN组抑瘤率高于pVIL-18HN组、pVIL-18VP3组、pVIL-18组和Hanks液对照组。研究结果提示，上述3种基因联合应用具有协同抑瘤效应。

新城疫病毒HN基因对肝癌细胞SMMC7721的细胞毒性研究

目的:探讨新城疫病毒HN基因对肝癌细胞SMMC7721的杀伤作用及其机制。方法:以脂质体介导方法在体外转染含新城疫病毒HN基因的质粒pVHN于细胞SMMC7721 24 h后,采用MTT法检测细胞活性;3,5-二羟基甲苯测定其唾液酸含量的变化;丫啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色,荧光显微镜观察细胞形态学改变;以及FCM检测病毒HN基因和HLA-A,B, C的表达。结果:体外转染pVHN能显著地降低细胞表面唾液酸含量(P<0.05),有效地杀伤肿瘤细胞SMMC7721;荧光显微镜观察可见典型的细胞死亡形态学改变;实验组细胞与对照组比较HN表达差异显著,HLA-A,B,C表达上调。结论:HN基因在体外能够显著降低肿瘤细胞表面唾液酸含量,同时,使其高表达HN抗原,上调HLA-A,B,C表达,从而,可能增强了肿瘤细胞的抗原性和免疫识别,诱导了细胞SMMC7721死亡。

载基因壳聚糖纳米粒的制备及免疫增强作用的初步研究

目的:制备壳聚糖载基因纳米粒,并对其体外转染效率及其在小鼠体内的免疫增强效果进行初步研究。方法:以构建的口蹄疫DNA疫苗为模型药物,采用复凝聚法制备纳米粒;用透射电镜观察形态;用纳米粒度分析仪测定粒径、多分散度和zeta电位;凝胶阻滞分析测定基因在纳米粒中的位置;用体外基因转染实验评价纳米粒的转染活性。用载基因壳聚糖纳米粒免疫雌性Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果:所制备的载基因纳米粒形态规则、大多成球形,平均粒径约为150nm,多分散度<0.26,zeta电位约为21mV;凝胶分析结果表明质粒DNA与壳聚糖分子间可以通过电性结合作用而完全结合,基因几乎全部被包裹在纳米粒内部;体外基因转染实验表明壳聚糖作为一种新型的非病毒基因递送载体能够高效传递DNA进入BHK-21细胞,基因能够在该细胞中高效表达;小鼠免疫实验表明纳米粒不仅能诱导机体产生较高的细胞免疫水平,而且体液免疫水平也显著提高。结论:壳聚糖纳米粒能将基因递送到细胞内并且能够表达,小鼠免疫实验显示其具有良好的免疫增强效果。

新城疫病毒HN基因重组体对人胃癌细胞BGC-823凋亡作用机制研究

目的本实验研究旨在探讨含新城疫病毒HN基因的重组质粒对人胃癌细胞BGC-823凋亡的联合作用机制。方法将含有HN基因的重组质粒pIRVP3IL-18HN经脂质体介导转染人胃癌细胞BGC-823,通过MTT方法检测细胞活力;电镜下观察细胞形态;罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位(△Ψ)和活性氧(ROS)水平变化;底物染色反应检测Caspase-3活性。结果重组质粒pIRVP3IL-18HN转染人胃癌细胞BGC-823后,MTT法结果显示致肿瘤细胞死亡率升高,细胞活力下降;电镜观察肿瘤细胞呈现明显凋亡状态;与阴性空白质粒对照显示,线粒体△Ψ下降,ROS水平升高;Caspase-3活性被激活。结论含新城疫病毒HN基因的重组质粒可以诱导人胃癌细胞BGC-823进入特定的凋亡程序,从而导致人胃癌细胞BGC-823的凋亡。

共表达O型口蹄疫病毒3C、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒免疫原性研究

目的:对筛选到的一株共表达O型口蹄疫病毒3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18进行免疫原性研究。方法:分别用重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18、rFPV-P1-2A-3C和对照组282E4株FPV、PBS对小鼠进行免疫接种,并检测各免疫组的T淋巴细胞亚类数量、CTL杀伤活性及抗体效价。结果:重组鸡痘病毒疫苗组免疫小鼠T淋巴细胞亚类数量,CTL杀伤活性和抗体效价均显著高于对照组,且重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18的小鼠T淋巴细胞亚类数量和CTL特异性杀伤活性与rFPV-P1-2A-3C相比,差异显著。结论:为开发新型FMDV疫苗奠定了实验免疫基础。

HIV-2gag-gp105嵌合基因DNA疫苗对小鼠的免疫原性研究

利用真核表达载体 pVAX1 构建 HIV-2 gag-gp105 嵌合基因的重组质粒 pVAX1gag-gp105,将其转入 BHK21细胞中,利用间接免疫荧光方法检测其表达情况。进一步分别将核酸疫苗质粒 pVAX1gag-gp105、对照组质粒pVAX1 和 PBS 溶液经肌肉注射免疫 BALB/c 小鼠,检测免疫小鼠脾 CD4+、CD8+T 细胞亚群的数量,脾特异性 CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,重组核酸疫苗质粒 pVAX1gag-gp105 疫组小鼠脾 CD4+、CD8+T 细胞亚群的数值均比对照组高( P<0.01),脾特异性 CTL 杀伤活性与对照组相比差异极显著(P<0.01),血清抗体滴度显著高于对照组(P<0.01) 。以上结果表明,HIV-2 gag-gp105 嵌合基因 DNA 疫苗对 BALB/c 小鼠具有良好的体液和细胞免疫原性。

新型抗HIV-1重组导向制剂SL41在毕赤酵母中的表达及活性实验

以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础,通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxinA,SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41,线性化后,采用电转化法整合入巴斯德菌毕赤酵母GS115中,经His+MutS表型鉴定、PCR分析以及G418筛选获得高拷贝重组转化子.摇瓶培养、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,目的蛋白得到良好表达,表达量最高可达到47.9 mg/L.目的蛋白经初步纯化后,用于制备的HIV-1感染靶细胞复制模型进行抗体亲和力测定、细胞结合活性测定和细胞杀伤活性研究,结果显示,目的蛋白能够很好地与靶细胞模型中的HIV-1外膜蛋白gp160发生结合反应,并可介导特异的CTL反应,对靶细胞具有明显的杀伤活性,表明获得了具有生物活性的抗HIV-1重组导向制剂.

禽流感病毒H5HA、H7HA、H9HA亚型血凝素基因在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统进行了禽流感病毒H5HA、H7HA及H9HA亚型血凝素基因的真核表达研究。首先将H5HA、H7HA及H9HA基因片段分别插入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-H5HA、pPIC9K-H7HA和pPIC9K-H9HA;再将所获重组质粒分别经SacⅠ、BglⅡ及SalⅠ线性化后,电转化GS115感受态细胞,以插入/替换的方式进行重组,并经MD平板与MM平板筛选,及PCR鉴定,得到重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-H5HA、GS115/pPIC9K-H7HA及GS115/pPIC9K-H9HA;用甲醇诱导分泌表达目标蛋白。经SDS-PAGE和Western-blotting检测,结果表明,H5HA、H7HA及H9HA蛋白在毕赤酵母中均获得表达。酵母表达了上述目的蛋白,可直接进行抗原检测,并可用于抗体检测试剂盒及亚单位疫苗制备的辅助研究。

小鼠对HIV-2gp105核酸疫苗免疫应答的研究

目的: 探讨HIV- 2gp105基因核酸疫苗在小鼠体内的免疫应答, 为开发HIV- 2核酸疫苗提供实验依据。方法:将HIV- 2外膜蛋白 (gp105 )基因插入真核表达质粒载体pVAX1中, 构建pVAX1 gp105重组表达质粒。将其肌注免疫BALB/c小鼠, 用ELISA法检测小鼠血清抗HIV -2抗体, 用流式细胞仪测定CD4+、CD8+ T细胞亚群数, 以乳酸脱氢霉释放法检测脾特异性CTL的杀伤活性。结果: 重组质粒pVAX1 -gp105免疫组小鼠的血清抗体滴度、脾T细胞亚群的数量及特异性CTL的杀伤活性, 均明显高于对照组, 分别为P<0. 01, P<0. 05和P<0. 01。结论: HIV -2gp105核酸疫苗能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫。

新城疫病毒HN基因诱导人肺癌细胞SPC-A1凋亡的作用机制

为了探索新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(HN)基因对人肺癌细胞SPC-A1的作用及机制,将含有HN基因的重组质粒pVHN经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,通过MTT方法检测细胞活力;采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色分析肿瘤细胞凋亡;罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位(ΔΨm)和活性氧水平变化;流式细胞仪分析MHC-Ⅰ分子表达;底物染色反应检测caspase-3活性.结果重组质粒pVHN转染人肺癌细胞SPC-A148h后,细胞活力明显降低;AO/EB染色可见明显的细胞凋亡形态学变化;与空质粒对照相比,线粒体ΔΨm下降(P<0·01),活性氧水平升高(P<0·05);细胞表面MHC-Ⅰ分子表达上调(P>0·05);caspase-3活性增强(P<0·01).以上结果提示,新城疫病毒HN基因能够上调SPC-A1细胞表面MHC-Ⅰ分子表达,并通过上调ROS水平,下调线粒体ΔΨm,进而激活caspase-3,最终诱导人肺癌细胞凋亡.

鸡贫血病毒VP3基因与人IL-18基因的共表达对人肝癌细胞BEL-7402的作用

目的利用凋亡素和IL18基因的抗肿瘤优势,设计构建共表达凋亡素和hIL-18基因的真核重组子,检测其在体外对人肝癌细胞BEL7402的作用效果,旨在探索新的肿瘤基因治疗方法。方法将凋亡素VP3基因与hIL-18基因一同克隆到真核表达载体pVAX1上,构建重组质粒pVVP3IL-18,经脂质体介导,转染人肝癌细胞BEL7402,AO/EB染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪分别分析凋亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化,透射电镜分析凋亡细胞超微结构变化。结果随着转染时间的延长,重组质粒pVVP3IL18所表达的目的蛋白对BEL7402细胞的杀伤作用逐渐增强,作用48h,形态学观察表明BEL7402细胞发生明显的凋亡,凋亡率可达(56.5±11.9)%,并且大部分细胞为TUNEL阳性着色,流式细胞术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰,透射电镜观察可见细胞核固缩、染色质聚集等典型的凋亡超微结构变化。结论联合应用凋亡素与hIL18基因,在体外对人肝癌细胞BEL7402具有明显的凋亡诱导作用。

共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18的重组鸡痘病毒的构建

目的:为获得能有效预防O型口蹄疫病毒的重组鸡痘病毒活载体疫苗奠定基础。方法:在O型口蹄疫病毒P1-2A基因上游引入Kozak序列,下游通过Linker与细胞因子IL-18联接,获得P1-2A基因与猪IL-18基因融合表达基因盒P1-2A-IL-18,将该表达基因盒克隆至鸡痘病毒中间转移载体pUTAL-3C中,构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-3C-P1-2A-IL-18。通过脂质体转染法,将pUTAL-3C-P1-2A-IL-18与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU三次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株。结果:经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-IL-18基因盒。结论:成功获得了一株共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘毒疫苗候选株rFPV-3C-P1-2A-IL-18。

新型抗HIV-1蛋白GRFT的构建、表达及活性研究

根据已知的新型抗HIV-1蛋白Griffithsin(GRFT)基因氨基酸序列,推测其DNA编码序列,对密码子优化及修饰后进行全基因化学合成,连接到原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,获得目的蛋白.SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,目的蛋白得到良好表达并具有抗原活性.对表达条件进行了优化,在最佳表达条件下,目的蛋白的表达量可占菌体总蛋白的55.84%.利用Ni2+-NTA柱亲和层析法进行目的蛋白的复性和纯化,凝胶成像系统扫描分析表明,其纯度可达94.06%.运用Dot-ELISA法进行复性蛋白的抗原结合活性检测发现,目的蛋白可与HIV-1膜蛋白抗原特异性结合,初步证明所表达的重组蛋白具有良好的体外结合活性.基于制备的能够表达HIV-1 gp120基因的靶细胞模型,运用IFA法开展目的蛋白的细胞结合活性研究,结果发现,目的蛋白能够与靶细胞发生特异性反应,表明成功制备了具有生物活性的新型抗HIV-1蛋白GRFT,为进一步研制新型抗HIV-1基因工程药物及其靶向治疗制剂奠定了基础.

表达新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒的构建及其抑瘤作用

目的：构建表达新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN,探讨vFVHN对体外培养人肝癌细胞SMMC7721的抑制作用和对小鼠荷肝癌模型的体内抑瘤效果。方法：以野生型鸡痘病毒(fowl poxvirus,FPV)282 E4株为载体,构建表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN。采用5-溴-2-脱氧尿苷(5-bromo-2-deoxyribouri- dine,BrdU)加压法筛选重组体,并通过RT-PCR和Western blot等方法对其进行鉴定。采用噻唑蓝(methylthiazoletetrazolium,MTT)染色法检测vFVHN对人肝癌细胞SMMC7721的杀伤率,并通过检测抑瘤率观察其在C57BL/6小鼠荷肝癌模型的抑瘤效果。结果：成功构建重组鸡痘病毒vFVHN,其对SMMC7721细胞的杀伤率为43．37%,对C57BL/6小鼠肝癌模型的抑瘤率为20．65%。结论：重组鸡痘病毒vFVHN可有效杀伤体外培养的人肝癌细胞SMMC7721,并对C57BL/6小鼠荷肝癌模型体内的实体肿瘤有一定抑制作用。

含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组腺病素的构建及鉴定

目的：构建表达新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶（Hemagglutinin—neuramidinase，FIN）基因的重组腺病毒，为进一步研究HN基因对消化道肿瘤的抑制作用及分子机制建立基础。方法：用BamHI和XbaⅠ双酶切质粒pVHN，将获得的HN基因片段连接入穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA，构建含HN基因的穿梭质粒pacAd5-HN。利用PacI单酶切对pacAd5-HN和腺病毒基因组质粒（pAd5）进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞，分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Western blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定，并测定所获得重组病毒的滴度。结果：所构建重组病毒可有效表达HN基因，表达产物分子量约为63kD，重组病毒滴度为10^8～10610PFU／ml。结论：成功构建含HN基因的重组腺病毒，所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求。

基因治疗用质粒DNA的制备工艺

目的探索基因治疗用质粒DNA的制备工艺。方法以CaCl2沉淀法去除大分子RNA,Q-Sepharose和SOURCE两步离子交换层析法去除染色体DNA、小分子RNA、蛋白质等杂质,并对各步骤样品进行检测。结果质粒pIRVP3HNIL18终产品的产量为1.638mg质粒DNA/g细菌,纯度为1.839,相对回收率为12.55%,蛋白质含量为0.0028mg/ml,未检测到RNA和染色体DNA。结论此工艺可有效去除质粒DNA制备过程中产生的杂质,可应用于药剂水平质粒DNA的制备。

含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切质粒pVAX1-Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin.利用PacⅠ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Western blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录,表达产物的相对分子质量约为13kDa,与CVA阳性对照一致;所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白,该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性,重组病毒滴度为1011PFU/L.结论:成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求.

O型口蹄疫病毒O/LZ株基因组全长cDNA的构建

目的构建O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)O/LZ株基因组全长cDNA。方法根据FMDV基因组和克隆载体的限制性内切酶酶切位点,将FMDV基因组设计为4段,进行反转录和扩增(RT-PCR),得到的片段分别克隆到质粒pMD18T-vetcor,筛选阳性重组质粒,测序正确的重组质粒(pMD18-S、pMD18-I、pMD18-P1和pMD18-P2)保存备用。然后对S区、I区和P2片段重新设计引物,其中S区的上游引物引入T7启动子序列;I区上游引物引入6个C,下游引物带有FMDV基因组中唯一酶切位点NruⅠ;用于3′端扩增的下游引物引入16个T,并以pMD18-S和pMD18-I为模板,对S区和I区进行融合PCR获得IS,以pMD18-P2为模板对P2片段进行2次PCR,获的带16个T的P3片段。将扩增片段克隆到pMD18T-vetcor,在pBuescriptⅡSK(-)中进行长片段的连接,获得基因组全长cDNA克隆。结果获得O型FMDV O/LZ株全基因组,并在此基础上构建了O/LZ株FMDV全长cDNA。结论成功构建了O型FMDV O/LZ基因组全长cDNA克隆,为进一步获得具有感染性的FMDV分子克隆,并研究该病毒基因组结构和功能奠定了基础。

长春地区人群HEV流行特点及病毒基因型分析

目的探讨长春地区戊型肝炎病毒(HEV)在人群中的感染情况及戊型肝炎病毒系统进化关系。方法用抗-HEV抗体试剂盒检测人血清中的抗体;对部分血清和粪便标本用逆转录聚合酶链式反应的方法(RT-PCR)检测HEV RNA,并对PCR阳性产物进行克隆测序,然后将序列进行分析。结果长春地区各年龄组共4944份人血清中有1127份为抗-HEV抗体阳性,阳性率为22.79%;其中男性阳性率为34.27%,女性阳性率为10.88%。20岁以下人群感染率为1.00%左右,自20岁起男性和女性分别以每年接近10.00%和3.00%的速度平稳上升。戊肝感染者中男性与女性的抗体阳性率之比为3.3:1,随着年龄上升,人群中戊肝感染者的抗体水平也缓慢上升。我们从急性戊肝患者血清中检测到1份HEV RNA阳性样本,从急性戊肝患者粪便中检测到2份为HEV RNA阳性样本,序列分析显示从我们克隆出的3株HEV的核苷酸序列的同源性为91.2-99.1%,该3株序列在ORF 2区438bp同1-4型间核苷酸同源性分别为:77.8%-82.3%、77.2%-78.1%、77.2%-99.1%、85.2%-95.2%;结论HEV在各年龄段人群中均有流行,但在年龄段20岁人群后的流行率呈逐年增长趋势,说明长春地区HEV感染主要发生在成年后。人感染的HEV的基因序列与猪群戊型肝炎病毒的基因Ⅳ型同源性最高。由进化关系看在长春地区人HEV与猪HEV不能分为不同的两支,说明长春地区人HEV和猪HEV很可能是由同一支分支进化而来。

共表达HIV-1 gp120与IFN-α重组鸡痘病毒诱导特异性CTL的初步研究

目的:探讨共表达HIV -1gp12 0与IFN- α重组鸡痘病毒诱导小鼠产生特异性的CTL杀伤活性。方法:将重组鸡痘病毒经肌肉注射免疫BALB c小鼠后,制备小鼠脾淋巴细胞悬液。以免疫小鼠的脾淋巴细胞为效应细胞,以表达HIV- 1结构蛋白的P815细胞为靶细胞,用乳酸脱氢酶释放法测定免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性。结果:重组病毒可有效地诱导特异性CTL的产生,且重组病毒免疫组小鼠脾特异性CTL对靶细胞的杀伤活性显著高于FPV对照组(P <0 .0 1)和PBS对照组(P <0. 0 1)。结论:共表达HIV- 1gp12 0和IFN -α的重组鸡痘病毒可激发强烈的细胞免疫,可作为我国HIV- 1疫苗候选株。