HIV-1假病毒感染未成熟树突状细胞实验研究

目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的HIV-1假病毒;通过HIV-1假病毒感染未成熟树突状细胞(immatural dendritic cell,iDC)实验探讨病毒与细胞的相互作用。方法:利用慢病毒包装系统构建携带EGFP基因的HIV-1假病毒,通过RT-PCR扩增HIV-1假病毒中的EGFP基因;HIV-1假病毒感染iDC,对HIV-1假病毒感染iDC后的基因组整合和转录水平进行检测,观察被感染iDC中EGFP基因的表达。结果:构建的HIV-1假病毒通过RT-PCR结果显示扩增得到EGFP基因;HIV-1假病毒感染iDC后,在基因组整合和转录水平检测中都扩增得到了EGFP基因,荧光显微镜观察被HIV-1假病毒感染的iDC,观察到iDC表达绿色荧光蛋白。结论:成功构建携带EGFP基因的HIV-1假病毒;HIV-1假病毒可以感染iDC,并将其遗传物质整合到iDC基因组中,并经过转录和翻译使iDC表达EGFP。

乳酸菌氧化锆珠破壁方法的优化及适用性研究

本实验旨在优化氧化锆珠破壁方法,以期筛选出较佳的破壁条件,提高蛋白得率。实验在菌体重量、研磨buffer和研磨时间这3方面对该破壁方法进行了优化,并通过SDS-PAGE来分析其破壁效果。在优化后的条件下,同时对6株乳酸菌进行破壁处理并通过SDS-PAGE来分析其破壁效果。结果表明:在菌体重量、研磨buffer、锆珠三者的加入比例(W/V/W)为0.013 g∶300μL∶1 g的条件下,研磨15 min,提取的蛋白图谱条带清晰,丰度高;RIPA、PBS、PENP、GUS作为研磨buffer时,提取的蛋白图谱条带清晰且丰度高,而8 mol/L尿素作为研磨buffer时,图谱条带模糊且丰度低;6株乳酸菌经该方法破壁处理后,蛋白图谱条带均具有较高的丰度和清晰度。因此,对于乳酸菌的破壁,氧化锆珠破壁法具有快速、高效的优点。

发酵豆制品中乳酸菌分离及其鉴定和功能研究

从4类中国传统发酵豆制品(臭豆腐类、腐乳类、豆瓣酱类、豆豉类)中分离出具有益生功能的乳酸菌。利用MRS液体培养基培养,通过对菌株进行耐酸、耐小牛胆盐、表面疏水性、抗氧化和降胆固醇试验,确定菌株的物理特性,同时进行16S rDNA序列的比对,最终确定分离得到了4株乳酸菌,分别命名为C1,C2,F1和F2。初步鉴定C1,C2为嗜酸乳杆菌(L.acidophilus),F1,F2为戊糖片球菌(P.pentosaceus),4株菌株均具有潜在益生功能。

未成熟树突状细胞快速分离与体外诱导培养及其鉴定研究

目的:以人外周血来源的单核细胞为前体细胞,建立体外快速分离和诱导培养未成熟树突状细胞(Immature dendritic cell,iDC)的方法。方法:采用Ficoll密度梯度离心方法和MACS磁珠分选系统,收集高纯度CD14^+单核细胞;用rhGM-CSF、rhIL-4联合诱导培养CD14^+单核细胞,第4天获得未成熟树突状细胞(iDC),应用流式细胞术检测细胞表面标记(CCR5)和抗原吞噬能力,普通光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞表面和内部结构特征。结果:CD14免疫磁珠技术获得CD14^+单核细胞纯度达94%以上,诱导分化第4天的iDC具有CCR5特征性标志和吞噬能力,普通光学显微镜及电镜观察到iDC出现树突状细胞典型特征。结论:体外快速诱导培养是获得大量具有典型特征的iDC的有效方法,并可应用于进一步实验研究。

犬瘟热病毒H蛋白的原核表达及免疫原性的初步鉴定

本研究旨在对犬瘟热病毒(CDV)疫苗株H基因进行克隆及原核表达,并对产物的免疫原性做初步鉴定。根据犬瘟热病毒参考株Ondetstepoort的H基因序列,去除信号肽序列并选取其主要抗原表位设计引物,用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片段;产物克隆至表达载体pET28b并转化宿主菌RosettaTM,优化诱导表达条件,纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定、Western blotting分析及间接酶联免疫吸附试验(ELISA);并将纯化的H蛋白免疫小鼠,进行中和试验检测抗体效价。结果显示,PCR扩增得到1113bp DNA片段;在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导条件下可获得较高水平的表达;经SDS-PAGE鉴定,表达的H蛋白分子质量为42.38ku,与预期值相符;Western blotting显示,在42.38ku出现特异性目的条带;ELISA结果显示,表达的H蛋白能被抗CDV抗体识别,但与正常血清未发生非特异性反应;中和试验结果表明,血清中和抗体效价约为2-3.3。结果提示,H蛋白获得了正确表达,对CDV抗血清具有特异反应性,可作为实时检测动物机体免疫状况检测的候选抗原,为进一步研制犬瘟热抗体检测ELISA试剂盒和新型疫苗奠定基础。

基于Tet-On 3G的IFITM3诱导表达MDCK细胞系的建立及功能分析

利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒pTRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒pLVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3^+细胞百分数及定位分析.用含萤光素酶(Luciferase)报告基因的禽流感病毒H5/H7蛋白或VSV G蛋白包裹的假型慢病毒颗粒进行感染实验,检测萤光素酶活性.结果表明,筛选获得了携带人IFITM3的MDCK诱导表达细胞系,且IFITM3表达量与Dox剂量和诱导时间相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/mL,诱导12 h时IFITM3^+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;假型病毒感染及萤光素酶活性分析表明,IFITM3可显著抑制禽流感病毒H5,H7和VSV G蛋白介导的病毒进入,为深入探究其具体的抑制机制奠定了基础.

乙型脑炎病毒可视化分型基因芯片的制备

目的:制备乙型脑炎病毒(JEV)可视化分型基因芯片。方法:根据JEV的基因组序列,应用生物学软件设计JEV分型引物及探针,制备其可视化分型基因芯片;用生物素标记的引物PCR扩增目的片段,并与固定于玻片上的探针杂交,加入链霉亲和素标记的纳米金,银增强实现可视化;进行特异性、灵敏性及重复性试验。结果:探针特异地与相应的标记目的基因片段杂交,并在芯片上呈现较强的阳性杂交信号;2号探针能特异性检出JEV,3、4号探针可分别对Ⅰ型和Ⅲ型JEV进行分型;芯片对JEV质粒检测的灵敏度达105拷贝/mL;以蓝耳病病毒等5种病毒为对照,芯片只对JEV响应,具有特异性;制备的基因芯片具有批间、批内重复性。结论:制备的基因芯片具有高特异性、灵敏性及重复性,可以快速、准确、高通量地对JEV进行可视化分型检测。

寨卡病毒感染及致小头畸形机制研究进展

寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属，是一种具包膜的单股正链RNA病毒，主要以伊蚊为传播媒介。随着寨卡病毒相继在雅浦岛、法属波利尼西亚、巴西及其他拉丁美洲国家和地区暴发，寨卡病毒感染人数急剧上升，同时伴随着多例感染孕妇生产出小头畸形和其他先天性畸形新生儿的现象。

表达HIV-1 gag重组鸡痘病毒的构建与筛选

构建并筛选表达HIV-1 gag蛋白的重组鸡痘病毒,并对其进行鉴定。首先设计引物通过PCR技术扩增HIV-1 gag基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的鸡痘病毒穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-HIV gag。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR,RT-PCR,Western blot方法对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组鸡痘病毒基因组中,RT-PCR,Western blot结果表明HIV-1 gag在感染细胞内成功表达且具有抗原性。连续传代20次,PCR,RT-PCR,Western blot均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,而且病毒已经纯化。结论:成功获得表达HIV-1gag的重组鸡痘病毒,为进一步免疫试验研究奠定基础。

犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒的构建及免疫效果评估

研究选取犬瘟热病毒H蛋白基因为目的基因,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶切、连接等方法构建出重组人5型腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,两者共转染293AD细胞并包装出重组腺病毒。通过电镜负染、酶切鉴定、Western blot及一步生长曲线测定等方法进行病毒的生物学特性鉴定,证明犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒构建正确。犬分别肌肉接种CDV疫苗毒和重组腺病毒,并检测免疫后第14,28,42,56,70,84d时犬血清中抗CDV中和抗体的变化情况。结果显示,犬免疫重组腺病毒后体内产生的抗CDV平均中和抗体水平高于对照组,滴度最高达2-8。研究表明,正确构建的重组腺病毒具有良好的免疫原性,诱导产生的抗犬瘟热病毒中和抗体达到犬最低免疫保护水平,为进一步研发犬瘟热病毒活载体疫苗提供理论依据。

HIV-1 B亚型假病毒的制备与鉴定

目的制备携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和ENV包膜蛋白的HIV-1 B亚型假病毒用于感染研究,并建立可行的鉴定方法。方法双质粒共转染HEK293T细胞后收获病毒上清,TRIzol法提取病毒基因组并采用RT-PCR进行报告基因扩增,Western印迹和ELISA法检测病毒P24抗原。假病毒感染HIV-1允许细胞,进行报告基因检测、病毒滴度测定以及单轮感染活性实验研究。结果与结论建立了HIV-1假病毒制备与鉴定方法,制备获得了B型HIV-1假病毒,经鉴定具备感染SupT1和TZM-bl细胞能力,为HIV-1与宿主细胞相互作用研究奠定了基础。

猪肺巨噬细胞源IFN-λ1的分子克隆、表达与活性分析

Ⅲ型干扰素（interferonlambda，IFN-λ）在机体抗病毒固有免疫、适应性免疫、黏膜免疫及抗肿瘤免疫等方面发挥重要作用。本研究利用RT—PCR技术从猪肺巨噬细胞CRL2845中扩增获得猪IFN—x1基因（pIFN—λ1），并进行遗传进化分析和信号肽预测；将含信号肽的pIFNX1基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3．1中，通过常规的质粒转化、阳性茵落筛选、质粒提取及酶切鉴定，获得重组质粒pcDNA-plFNλ1；利用脂质体转染CRL2845细胞，转染48h后通过qRTPCR、Westernblot、间接免疫荧光方法分析pIFNX1表达及胞内定位；收集转染细胞总RNA，通过qRT—PCR方法分析OAS1、ISG15、PKR、WITM3等干扰素刺激基因的表达，并利用舍报告基因的痘病毒VTT—EGFP感染瞬时表达pIFN—λ1的CRL2845细胞，通过流式细胞术分析pIFN—λ1抗痘病毒效果。结果显示，成功在猪肺巨噬细胞中扩增获得pIFN—λ1基因，并在CRL2845细胞内成功表达；瞬时表达后选择性诱导OAS1、ISG15的表达，并可抑制约38％的痘苗病毒感染CRL2845细胞。结果表明，瞬时表达pIFN—λ1能选择性诱导部分干扰素刺激基因的表达，且具有抗病毒活性，为深入研究猪IFN-λ1在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机理及其应用奠定基础。

乳酸菌表达CRISPR gRNA载体的构建与鉴定

[目的]构建并筛选重组gRNA(向导RNA)表达质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX,并对gRNA在乳酸菌中的表达进行鉴定。[方法]通过PCR技术扩增复制子SH71、氯霉素抗性基因CM和gRNA表达盒片段。将CM片段分别与gRNA表达盒进行融合,再与SH71复制子进行无缝克隆。通过转化,构建重组质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX。应用PCR、RT-PCR、Real-Time PCR对重组质粒进行鉴定,gRNA表达验证及拷贝数检测。[结果]PCR及RT-PCR结果显示获得169 bp大小目的条带,表明获得重组质粒载体且该gRNA表达载体在植物乳杆菌WCFS1株、CGMCC1.557株、乳酸乳球菌MG1363株中均成功表达,绝对荧光定量PCR检测获得LDH-gRNA标准曲线为y=-3.480log X+45.34,扩增效率为93.8%;C9PX-gRNA标准曲线为y=-3.327log X+37.07,扩增效率为99.8%。[结论]为利用CRISPR基因编辑技术在乳酸菌中进行基因操作奠定基础,为乳酸菌载体构建提供方法。