表达PRRS病毒GP5、GP3和猪IL-18的核酸疫苗的构建及实验免疫研究

目的获得安全有效的防治PRRSV核酸疫苗。方法采用RT-PCR方法扩增了PRRSV长春分离株ORF5、ORF3基因,并将其插入真核表达载体pVAX1、pVIR-IL-18的CMV启动子下游,构建成真核表达质粒pVAX1-ORF5-ORF3和pVIR-IL18-ORF5-ORF3,通过Westernblot及IFA等检测目的基因表达产物。同时进行了Balb/c小鼠免疫试验,检测免疫后小鼠的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量。结果所构建的2个重组DNA疫苗质粒在真核细胞能进行有效的转录,并表达了目的蛋白(GP5、GP3)。pVIR-IL18-ORF5-ORF3免疫组的小鼠的ELISA抗体水平高于pVAX1-ORF5-ORF3和PRRS灭活苗免疫组,但差异不显著。CD8+T淋巴细胞亚群数量显著高于pVAX1-ORF5-ORF3和PRRS灭活苗组。结论IL-18对猪的细胞免疫功能具有明显的促进作用。

抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定。结果酶切及DNA序列测定鉴定正确。SDS-PAGE和West-ern Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75200的蛋白,与DT-hs120融合基因分子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体。结论成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达。

绿色荧光蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的表达

目的探讨异源基因在枯草芽孢杆菌中表达的可行性。方法以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的穿梭质粒为基本骨架,在大肠杆菌中完成含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组表达质粒的构建,通过酶切鉴定筛选阳性克隆,采用电转化的方法,将重组质粒转入枯草芽孢杆菌进行表达,通过检测GFP的存在,评价枯草芽孢杆菌对异源基因的表达。结果重组表达质粒pGJP-GFP酶切鉴定结果与预期片段大小相符。绿色荧光蛋白可在枯草芽孢杆菌中表达,且表达蛋白具有较好的生物学活性。结论利用枯草芽孢杆菌的自身启动子,可以实现外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达。

重组鸡痘病毒对豚鼠的生物安全性

目的检测重组鸡痘病毒在妊娠豚鼠及其子代豚鼠体内的安全性。方法重组鸡痘病毒以正常剂量和超大剂量同时免疫妊娠豚鼠和子代豚鼠,通过临床观察、病理组织学、PCR等方法,检测重组鸡痘病毒对妊娠豚鼠的毒性和子代豚鼠生长的影响以及子代豚鼠的病毒DNA残留。结果临床观察和病理组织学检测表明在整个实验期间,免疫重组鸡痘病毒的妊娠豚鼠精神状态、饮水、采食等临床表现一切正常,未表现出临床症状和不良反应,未造成早产、流产、死胎、弱胎;用正常和超大剂量免疫重组鸡痘病毒的子代豚鼠均未出现任何临床症状,内脏器官未见明显的病理变化,且未检测到病毒DNA。结论构建的重组鸡痘病毒生物安全性好,对妊娠豚鼠和子代豚鼠无安全威胁。

乳酸菌质粒提取方法的建立

目的建立简便、快速、安全的乳酸菌质粒提取方法。方法将文献报道的乳酸菌质粒提取方法和大肠杆菌质粒提取方法相结合,建立乳酸菌质粒提取方法。通过方法比较、溶菌酶浓度优化和酶切分析,验证该方法的可行性。结果用所建立的方法提取的乳酸菌质粒电泳与酶切图谱与文献报道的提取方法相比均无明显差异。溶菌酶最佳浓度为10mg/ml,避免了毒性物质溴化乙锭的应用,减少了溶菌酶的用量和溶液体积。结论所建立的方法可用于乳酸菌质粒的快速提取,为乳酸菌分子生物学研究奠定了基础。

高致病性禽流感的流行及其预防控制

禽流行性感冒（简称禽流感，Avian influenza，AI）也称禽流感综合征，是由A型流感病毒（Avian influenza vires，AIV）引起的急性、高度致死性、烈性传染病。该病已被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。AIV依据其外膜血凝素（Hemagglutinin，H）和神经氨酸酶（Neuraminidase，N）抗原性的不同，目前至少可分为15个H亚型（H1～H15）和9个N亚型（N1-N9）。由H5和H7亚型毒株（以H5N1和H7N7为代表）所引起的禽类疾病称为高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HeM），其发病率和病死率都很高，危害极大。

鹌鹑传染性法氏囊病与大肠杆菌混合感染的诊治

传染性法氏囊病（BID）是由双股核糖核酸病毒科传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起3～12周龄的雏鸡、青年鸡的高度接触性传染病,该病原主要破坏鸡的中枢免疫器官——法氏囊，造成机体的免疫抑制，导致感染鸡对其他致病因子的感染性增加和对其他疫苗的免疫应答能力下降，

吉林省猪圆环病毒Ⅱ型血清流行病调查分析

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）为圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属成员，是单股环状DNA病毒，是迄今发现的最小的动物病毒。PCV存在2种基因型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1未发现有致病性；PCV-2主要引起仔猪免疫缺陷的断奶仔猪多系统消耗综合症（Posl-weaning muhisystemic wasting syndrome，PMWS）的病原之一。猪是PCV的易感动物，主要是经口腔及呼吸道途径感染，少数怀孕母猪可经胎盘将PCV直接感染给仔猪。感染猪可从鼻液、粪、尿中排出病毒，并于2—15周龄时发生PMWS。

鸡传染性支气管炎与大肠杆菌混合感染的诊治

1发病情况2009年10月以来,吉林省某养鸡场饲养5000只育成蛋鸡,于4周龄左右发病,5周龄开始死亡,6周龄死亡达到高峰,发病率达50%,死亡率达10%。病鸡伴有呼吸道症状,饮水量增加,采食量减少。病程为1星期左右,疾病流行时间较长。

猪繁殖与呼吸综合征和大肠杆菌病混合感染的诊治

2009年,四平市某养殖场发生一起以妊娠母猪流产和仔猪呼吸道症状为主的疾病,现将诊断情况报告如下。1发病情况四平市某养殖户自繁自养存栏母猪60余头,妊娠母猪突然出现发热、呼吸困难等症状后而流产,

鸽传染性法氏囊病与巴氏杆菌病混合感染的诊治

传染性法氏囊病（IBD）是由双股核糖核酸病毒科传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起3－10周龄的雏鸡、青年鸡的高度接触性传染病,该病原主要破坏鸡的中枢免疫器官法氏囊,造成机体的免疫抑制,导致感染鸡对其他致病因子的感染性增加并对其他疫苗的免疫应答能力下降,其发病率高达70%－100%,死亡率在50%以上。

猪繁殖与呼吸综合征的诊治

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖和呼吸障碍的传染性疾病。母猪表现为流产、早产、死胎、木乃伊胎及弱仔等；仔猪和育肥猪表现为呼吸困难，发病率和死亡率高，对养猪业构成了严重的威胁。

鸽新城疫、巴氏杆菌混合感染的诊断

新城疫（Newcastle disease,ND）是由NDV（Newcastle disease Virus,NDV）引起的禽类的致死率极高的急性接触性传染病,其典型症状为呼吸困难,下痢,浆膜、粘膜出血,神经症状等,病禽常呈败血症经过,各种禽类均易感染本病。80年代以来,我国采取的综合防制措施已基本有效控制了该病大规模毁灭性流行;但近年来,出现新的流行趋势,

HIV-1复合多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒疫苗的构建及小鼠免疫原性

将HIV-1p24基因插入至人工设计的复合多表位基因MEG中,获得嵌合基因MEGp24;将MEGp24插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法筛选出重组病毒;将重组病毒大量制备并纯化后,分别于0,14,42天肌肉注射免疫BALB/c小鼠;第3次免疫后一周,采集小鼠全血与脾脏,分离血清并无菌制备脾淋巴细胞,ELISA法检测小鼠血清HIV-1抗体、脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-α和IL-2的含量,流式细胞仪测定CD4+,CD8+T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,重组病毒刺激小鼠产生HIV-1特异性抗体,出现T细胞亚类数量增加,产生针对HIV-1 H-2d限制性CTL表位的特异性靶细胞杀伤作用,同时免疫小鼠脾细胞在HIV-1抗原肽的刺激下分泌Th1类细胞因子的水平大幅增加.研究提示多表位嵌合基因重组FPV疫苗具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生HIV-1特异性细胞和体液免疫应答.

H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位核酸疫苗构建及表达研究

目的构建表达A型流感病毒多种表位的核酸疫苗,并研究其在幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)内表达产物的生物学活性。方法筛选流感病毒主要抗原(HA、NA、NP、M)表位基因,以生物信息学软件优化其排列结构,合成流感通用的复合多表位基因(Epi),以H5、H7亚型流感病毒HA融合表达基因为骨架,将多表位基因Epi插入构建H7HA-Epi-H5HA阅读盒,定向克隆至pVAX1,构建抗A型流感H3579亚型的pVAX1-H7HA-Epi-H5HA。最后将该重组质粒转染BHK细胞,提取细胞总RNA,以RT-PCR方法检测目的基因;以间接免疫荧光试验(IFA)初步测其表达产物抗原性。结果RT-PCR检测到目的基因;IFA检测到特异性荧光存在。结论本试验所构建的重组质粒pVAX1-H7HA-Epi- H5HA,在真核细胞内均获了有效地转录和表达;而且其表达产物均能与相应的抗体特异性结合,证明了其具有一定的生物学活性和抗原性,有望成为抗多种A型流感病毒的通用核酸疫苗。