应用核糖体展示技术筛选制备抗TNF-α人源抗体的研究

目的:构建人源核糖体展示抗体库,筛选制备抗TNF-α的特异性、高亲和力三结构域抗体(VH/K)。方法:应用核糖体抗体库技术,从类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞中分离、构建核糖体展示VH/K基因库;体外转录翻译后,以TNF-α重组蛋白作纯化抗原,采用亲和富集法淘选TNF-α特异性抗体基因;将筛选获得的VH/K基因克隆并在原核系统pET22b(+)/BL21(DE3)中实现可溶性表达;表达产物经进行ELISA鉴定,并对阳性克隆的生物学特性进行初步研究。结果:成功构建了库容量约为6.7×1012核糖体展示VH/K抗体基因库,在180个筛选克隆中,其中两株抗体TRB21、TRB409显示出极高的ELISA值,序列分析表明两株克隆具有全新的人源抗以TNF-α抗体基因,他们不仅可以特异识别TNF-α而且可以抑制以TNF-α对L929细胞的细胞毒性。结论:人源抗TNF-α特异性抗体的获得,为进一步研制抗TNF-α的特异性、高亲和力基因工程抗体奠定了基础。核糖体展示技术为体外筛选制备全人源抗体提供了一种简便、有效的技术平台。

颐心宁对束缚应激大鼠心电图、血清皮质醇的影响

目的 评价颐心宁抗应激性心肌损伤的效果。方法 动态观察颐心宁对束缚应激大鼠心电图、血清皮质醇的干预作用。结果 束缚应激 1,2 ,4周时 ,应激模型组大鼠心率增加、ST段明显移位、T波高耸直立 ,血清皮质醇水平增高 ;颐心宁干预组、颐心宁倍量组较单纯应激大鼠心率减慢、ST段移位减轻、T波直立幅度下降且多呈双相 ,血清皮质醇水平降低 ;而颐心宁 1/ 2量组、蒸馏水干预组与单纯应激大鼠比较则无统计学意义。结论 颐心宁具有抗应激性心肌损伤、改善心脏功能的作用 ,颐心宁对血清皮质醇的调节可能是其抗应激性损伤的作用机制之一。

应激机体适应的心血管分子基础的相关研究

心血管系统是多种应激因素作用的首要靶器官 ,它在应激机体的适应调控中具有非常重要的作用 ,对其分子基础的认识才刚刚开始。应激机体适应的心血管分子基础涉及到一个复杂的细胞内调控网络和多种内源性物质。本文就信号分子、受体、细胞内信息传导因素、相关的应激基因。

人源TNF-α抗体基因的克隆与表达

目的:在原核系统中高效表达抗TNF-α单克隆抗体VH/K21,以便进一步研究其生物学功能,预测临床应用前景。方法:以已筛选获得的TNF-α抗体基因VH/K21为模板进行PCR扩增,产物与其表达质粒进行双酶切,连接后克隆进入PET22b(+)/BL21(DE3)感受态中并在该原核系统中实现可溶性表达;对表达产物进行Western blotting、ELISA鉴定。结果:成功克隆与表达出可溶性的高效表达的人源TNF-α单克隆抗体。序列分析表明该克隆具有全新的人源TNF-α抗体基因,它可以特异识别人TNF-α。结论:人源TNF-α单克隆抗体的获得为进一步研制应用于临床的TNF-α人源抗体奠定了基础,也将为其他人源抗体的制备提供理论依据和技术基础。

bcl-2基因转染对热应激心肌细胞的保护作用

目的 探讨bcl 2基因转染对热应激心肌细胞的保护作用。方法 用胰酶消化法分离培养Wistar大鼠乳鼠心肌细胞 ,使其暴露于 39℃、41℃和 43℃水浴进行热应激。用脂质体转染法将bcl 2基因转染入心肌细胞 ,用免疫组织化学法检测转染结果。用生物化学法测定bcl 2基因转染对热应激前、后心肌细胞培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)活力的影响 ;用流式细胞仪 (FCM)测定bcl 2基因转染对热应激前、后心肌细胞凋亡率的影响 ;用台盼蓝染色法测定bcl 2基因转染对热应激前、后心肌细胞坏死率的影响。结果 经 39℃、41℃和 43℃热应激后 ,心肌细胞培养液中LDH活力明显增高 ,心肌细胞的凋亡率由 4.74%分别增加到 5 .12 %、16 .31%和 2 8.97% ,坏死率分别由 3.5 2 %、3.5 5 %、3.5 3%增加到 3.6 1%、5 .81%和 10 .80 %。bcl 2基因转染后 ,41℃和 43℃热应激引起的心肌细胞凋亡率明显降低 ,43℃热应激引起的心肌细胞培养液中LDH活力和心肌细胞坏死率也明显降低。结论 热应激可以引起心肌细胞损伤 ,细胞凋亡是热应激心肌细胞死亡的重要途径 ,bcl 2基因转染对热应激心肌细胞有保护作用。

应激心肌细胞中c-Jun氨基末端激酶对TR3磷酸化水平的调控

目的观察应激心肌细胞中JNK的磷酸化水平及其对核转录因子TR3磷酸化水平的影响。方法采用应激心肌细胞模型,以10-5mol/L糖皮质激素(GC)干预心肌细胞;采用免疫印记法检测细胞中JNK和TR3蛋白的磷酸化水平;应用JNK磷酸化的化学抑制剂SP600125观察JNK磷酸化的抑制对TR3磷酸化水平的影响。用Image Master誖2D Elite(Version 3.10)软件分析蛋白条带的灰度值;用SPSS12.0软件包对灰度值进行统计学分析。结果选取对照组的p-JNK蛋白灰度值(0.99)相比,GC干预心肌细胞10min、20min、40min、60min、90min时的p-JNK蛋白灰度值升高(分别为1.26、1.31、1.29、1.35、1.36)。选取对照组的p-TR3蛋白灰度值(0.83)相比,GC干预心肌细胞40min、60min、90min时的p-TR3蛋白灰度值升高(1.09、1.16、1.02)。与GC干预组的p-JNK蛋白灰度值(1.55)相比,SP600125+GC组的p-JNK蛋白灰度值降低(1.21);与GC干预组的p-TR3蛋白灰度值(1.67)相比,SP600125+GC组的p-TR3蛋白灰度值降低(1.03)。结论在应激心肌细胞中,JNK活化,磷酸化水平升高,并进而促使核转录因子TR3发生磷酸化。

缺氧冷损伤血管一氧化氮合酶活性的变化及其生物学意义

目的 观察缺氧寒冷损伤血管一氧化氮合酶 (NOS)活性的变化 ,并研究超氧化物歧化酶 (SOD)和维生素C(VC)对这种变化的影响 ,为缺氧寒冷损伤的防治开拓新的思路。方法 分离Wistar大鼠主动脉并使其暴露于缺氧或 /和寒冷环境中 ,以全自动生化分析仪测定血管培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)活性 ,以Griess化学法观测血管NOS活性 ,以肾上腺素自氧化法测定血管SOD活性。结果 缺氧和寒冷损伤使血管NOS活性较对照组显著下降 ,分别达 18 2 %和 19 1% ,缺氧寒冷复合损伤更使血管NOS活性下降达 2 5 9% ;NOS的这种变化具有明显的时间依赖性 ,并与相应血管培养液中LDH活性有显著负相关关系 ;缺氧或 /和寒冷损伤血管SOD活性亦显著下降。当血管受到缺氧或 /和冷冻后立即给与SOD(2 0 0u/ml)或VC(5 0mg/ml)可使缺氧或 /和寒冷损伤血管NOS活性升高 ,SOD活性复升 ;对血管培养液中LDH的测定表明 ,SOD和VC对缺氧冷损伤血管具有一定的保护作用。结论 血管NOS活性的降低与缺氧冷损伤发生密切相关 ,可望通过抗氧化剂的使用 。

冷损伤血管脂质过氧化水平的变化及其意义

目的 探讨自由基在血管冻结损伤发生中的作用及其对制定治疗措施的意义。方法 分离Wistar大鼠胸主动脉 ,将其置于 - 2 0℃冰浴中分别冷冻 1、2、4min ,观察血管内皮细胞冻结后的损伤情况 ,并探讨超氧化物歧化酶 (SOD)和维生素C对冻结所致血管损伤的保护作用。分别测定血管培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)活力及血管中丙二醛 (MDA)水平。结果 血管暴露于 - 2 0℃环境 1、2、4min后 ,血管培养液中LDH活力分别较对照组升高 12 5 .6 %、15 6 .3%、184.2 % ,活力的增加与冷暴露时间呈正相关 (r =0 .932 ,P <0 .0 5 ) ;血管中MDA含量亦有不同幅度的增加 ,较对照组分别提高5 6 .5 3 %、6 2 .38%和 42 .99%。对冻结后的血管给予SOD(2 0 0U)或维生素C(12 .5mg)处理 ,可以明显降低血管MDA含量及培养液中LDH的活力。结论 脂质过氧化是冻结所致血管损伤的重要原因 ,SOD、维生素C可以通过清除自由基等抗氧化作用使冷冻对血管造成的损伤程度下降 。

细胞外热休克蛋白70及其生物学功能

热休克蛋白(HSP)一直被描述为一种细胞内蛋白质在胞内发挥一系列生物学作用,参与细胞内蛋白质的折叠、装配、降解和修复过程。近年来,有研究发现HSP70能被主动释放到胞外,成为细胞外HSP70(extracellular HSP70,eHSP70),但关于其功能尚不清楚。循环HSP70水平与多种疾病进程密切相关。有研究发现暴露于物理和心理刺激源作用下,HSP70可能通过脂筏或Exosome介导的分泌途径释放到细胞外,作为一种生物活性因子影响多种疾病的进程。