大鼠脂肪干细胞在纳米羟基磷灰石-壳聚糖-果胶/壳聚糖-明胶支架的成骨向分化研究

目的探索纳米羟基磷灰石-壳聚糖-果胶/壳聚糖-明胶(nHCP/CG)支架对大鼠脂肪干细胞(r ADSC)定向成骨分化的影响,为其临床应用提供理论支持。方法选择SD成年大鼠5只,体质量60~80 g,雌雄不限。从SD成年大鼠两侧腹股沟脂肪组织原代分离、培养并鉴定r ADSC,然后将其接种在nHCP/CG支架材料上,并以壳聚糖-明胶(CG)支架为对照。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法、Live/Dead及苏木精-伊红(HE)染色法评价支架的细胞相容性;在添加和不添加成骨诱导剂培养条件下,以碱性磷酸酶(ALP)活性及多种免疫组织化学染色测定r ADSC在nHCP/CG支架中的成骨分化行为。结果r ADSC具有间充质干细胞的特性,其在nHCP/CG复合支架材料上活性较好。nHCP/CG支架较CG支架更利于r ADSC的黏附和增殖;r ADSC在nHCP/CG支架中培养1 d、3 d、7 d时细胞数量明显高于CG支架中的细胞数量(0.432±0.028 vs 0.174±0.004、0.532±0.017 vs 0.291±0.023、0.595±0.014 vs 0.754±0.038)且差异有显著统计学意义(P<0.01)。r ADSC在nHCP/CG支架和CG支架中培养14 d和21 d均表现出较高的ALP活性;第14天时,在CG支架诱导培养细胞的ALP活性大于常规培养(0.298±0.029 vs 0.224±0.008),差异有统计学意义(P<0.05);在nHCP/CG支架中培养14 d和21 d的细胞加入诱导剂(0.224±0.006 vs 0.271±0.010、0.181±0.012 vs 0.209±0.009),ALP活性小于常规培养且差异有统计意义(P<0.05)。无论是否添加成骨诱导剂,接种在nHCP/CG支架上的r ADSC茜素红染色、Von Kossa染色、Ⅰ型胶原及Ⅷ因子免疫组化染色均表达为阳性,说明nHCP/CG支架能够自发促进r ADSC向成骨细胞分化。结论r ADSC可作为骨组织工程的种子细胞;nHCP/CG支架材料能够提供支持r ADSC黏附和生长的微环境,具有良好的生物相容性,更为重要的是能够自发诱导r ADSC定向成骨分化,有望成为一种应用于临床的骨组织工程支架材料。

香菇多糖对抗模拟微重力环境培养的淋巴细胞免疫功能抑制的实验研究

本研究旨在探索香菇多糖对抗旋转式细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)模拟微重力环境下淋巴细胞免疫功能降低的作用。体外分离培养小鼠脾淋巴细胞,在正常重力环境和RCCS模拟微重力环境下分别添加10、20和40μg/ml的香菇多糖溶液,培养24、48和72 h取样,用MTT法、ELISA和流式细胞术分别检测香菇多糖对细胞增殖度、细胞因子分泌量和表面标志表达的影响。结果表明,10、20和40μg/ml香菇多糖在处理时间内对小鼠脾淋巴细胞增殖无明显促进作用;不同浓度的香菇多糖均可提高小鼠脾淋巴细胞在模拟微重力环境下IL-2和IFN-γ的分泌量和促进小鼠脾淋巴细胞表面CD4和CD8分子的表达。结论:香菇多糖具有对抗模拟微重力环境造成的淋巴细胞免疫功能降低的作用。

模拟微重力环境下虫草多糖促进淋巴细胞增殖和CD分子表达的实验研究

本研究旨在探索旋转式细胞培养系统(RCCS)模拟微重力环境下虫草多糖促进淋巴细胞增殖和表面CD分子表达的作用。体外分离培养小鼠脾淋巴细胞,在RCCS模拟微重力环境中分别添加6.25、12.5、25和50μg/ml的虫草多糖溶液培养,在24、48和72 h检测虫草多糖对淋巴细胞增殖及表面CD分子表达的作用。结果表明,模拟微重力环境抑制了淋巴细胞的增殖能力,25和50μg/ml虫草多糖对淋巴细胞的增殖和CD4、CD8的表达均具有促进作用,但50μg/ml虫草多糖促进淋巴细胞增殖的作用随时间延长变为抑制作用。结论:适宜浓度范围内的虫草多糖具有对抗模拟微重力环境下淋巴细胞增殖能力下降和表面CD分子表达减少的作用,为筛选对抗失重效应、促进免疫力的药物提供理论依据和实验基础。

新生大鼠心肌组织Telocytes的组织形态学研究

本研究以新生大鼠心肌组织为研究对象,分别采用组织学、免疫组织化学及甲苯胺蓝染色方法,对新生大鼠心肌组织中telocytes形态特征和免疫标志进行观察与分析。其中,组织学染色与甲苯胺蓝染色结果显示,新生大鼠心肌组织中存在大量间质细胞,其中telocytes的分布多紧贴于心肌纤维束周围或纤维之间,细胞呈现长梭形、纺锤形及三角形等多种形态,胞质少、有一至多条长而细的细胞突起,胞核结构较致密、着色较深。免疫组化染色结果进一步证实新生大鼠心肌组织中其不但表达间质细胞的免疫标志vimentin,有些还表达c-kit/CD117和CD34两种与干细胞相关的表面标志物。本研究从组织形态学的角度阐明了telocytes的基本特征和分布,为进一步揭示其功能奠定了在体形态结构上的基础。

氧化石墨烯促进NIH3T3细胞在石墨烯/明胶纳米膜上的增殖与粘附的实验研究

本研究旨在探索氧化石墨烯/明胶(graphene oxide/gelatin)薄膜材料对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)活性、增殖与粘附能力的影响规律。利用扫描电镜观察材料表面微观结构。活-死细胞染色检测氧化石墨烯/明胶薄膜材料上的NIH3T3细胞活性,CCK-8法进行细胞增殖评价。利用免疫荧光、Westernblot检测Vimentin表达,采用实时定量RT-PCR检测粘附相关基因α-actin、ColⅠ、ColⅢ、Vinculin、Vimentin的mRNA表达。添加氧化石墨烯后材料表面形成明显的褶皱结构。与对照组相比,实验组的成纤维细胞活性良好,具有更强的增殖能力,且高表达α-actin、ColⅠ、ColⅢ、及Vinculin。氧化石墨烯/明胶薄膜材料促进NIH3T3细胞的增殖与粘附。

基于三维细胞培养的组织工程肿瘤研究进展

肿瘤的发生与进展始终伴随着与微环境之间的相互作用,微环境中诸多的生物、物理和化学因素调控了肿瘤最终的命运与转归。肿瘤在适应和利用微环境的同时也会对微环境进行结构与功能的重塑。传统的二维(2D)细胞培养体外模型及动物整体模型无法很好地模拟肿瘤与微环境之间复杂的生物事件。基于三维(3D)细胞培养的组织工程肿瘤实验体系能够在一定范围内,模拟肿瘤细胞在体生长状态,有望作为2D培养模型和动物整体模型之间的桥梁,成为肿瘤研究模型体系中的重要组成部分。本文综述了基于3D细胞培养技术的组织工程肿瘤的基础及应用研究进展。

MicroRNA-20a对干细胞增殖和骨向分化调控作用的研究进展

miRNA是一种非编码小RNA。MiR-20a是miR-17-92家族一员,位于13号染色体上,此家族的成员在组织和器官发育中具有重要作用,是脊椎动物发育所必须的。而miR-20a作为miR-17-92家族一员,其不仅是重要的癌基因,而且在干细胞增殖分化中也有重要作用,故本文主要对miR-20a对干细胞增殖,成骨分化及骨代谢的影响及机制做一综述。

壳聚糖水凝胶与星形胶质细胞体外生物相容性评价的实验研究

研究壳聚糖水凝胶材料与星形胶质细胞的体外生物相容性,初步探讨壳聚糖水凝胶作为神经组织工程支架材料的可行性。利用氯化壳聚糖、β-甘油磷酸钠和羟乙基纤维素制备壳聚糖水凝胶,MTT法评价其细胞毒性;体外培养鉴定新生Wistar大鼠脑皮层星形胶质细胞;壳聚糖水凝胶与星形胶质细胞体外共培养,观察星形胶质细胞在材料上的生长;MTT法检测接种后1、35、、7d的细胞增殖度。体外成功制备壳聚糖水凝胶,该材料无细胞毒性;体外分离、培养得到状态良好的星形胶质细胞;体外星形胶质细胞在材料上培养呈星形,生长良好,有分支状突起形成;MTT结果表明,材料-细胞共培养组中的细胞增殖度明显高于单纯细胞组(P<0.001)。壳聚糖水凝胶与星形胶质细胞在体外具有良好的生物相容性,有望作为神经组织工程支架材料。

基于脱细胞基质的心脏全器官再造研究进展

心脏移植是终末期心脏病患者唯一有效且经济的治疗手段,然而,却面临着供体严重不足及移植后免疫排斥等问题。近年来,基于心脏全器官脱细胞技术进行心脏再造的研究为心脏移植供体来源提供了新的出路,有望解决这些问题。我们对基于脱细胞基质的心脏全器官再造研究进展进行了综述。

棕色脂肪干细胞与白色脂肪干细胞移植对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的对比研究棕色脂肪干细胞(BADSCs)与白色脂肪干细胞(ADSCs)治疗急性心肌梗死大鼠的效果。方法采用酶消化法分别分离大鼠腹股沟脂肪组织及肩胛骨下脂肪组织,获得ADSCs与BADSCs,并进行流式分析与多谱系分化鉴定。30只雄性SD大鼠随机分为PBS对照组、ADSCs移植组及BADSCs移植组,建立急性心肌梗死模型,将各组对应细胞直接注入大鼠心肌梗死边缘区。移植后4周进行心功能检测并利用组织学检测移植细胞的体内分化与血管化作用。结果术后4周,与PBS对照组相比,ADSCs以及BADSCs移植组大鼠心功能均显著提高(P<0.05),且纤维化程度显著减弱(P<0.05)。免疫荧光结果表明,移植的BADSCs成心肌分化数量显著高于ADSCs。免疫组化结果显示,ADSCs移植组以及BADSCs移植组大鼠心肌梗死区血管密度均较PBS对照组显著增加(P<0.05),ADSCs移植组血管密度显著高于BADSCs移植组(P<0.05)。结论不同来源脂肪干细胞移植均具有改善心肌梗死患者心功能的作用,虽然BADSCs体内促血管化作用不如ADSCs,但其具有明显的心肌分化能力,可有效改善心脏功能。

地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞Bax/Bcl-2表达的影响

目的探讨地黄低聚糖(RGOs)对过氧化氢-血清饥饿诱导的小型猪脂肪组织来源干细胞(ASCs)Bax、Bcl-2表达的影响。方法过氧化氢(200μM)联合血清饥饿(H2O2/SD,6 h)建立小型猪ASCs凋亡模型。RGOs(0.01 g/L、0.1 g/L、1 g/L、10 g/L)预处理12 h并继续干预6 h。Western-blot法测定细胞Bax、Bcl-2的表达。结果 RGOs在一定浓度范围(0.1 g/L^10 g/L)可以减轻H2O2/SD引起的ASCs损伤,表现在Bax表达下调,Bcl-2表达上调。结论地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞的凋亡具有保护作用。

MWNTs/PMMA薄膜对大鼠棕色脂肪来源的心脏干细胞生物学特性的影响

近年来,鉴于心肌组织独有的电生理特性,应用导电纳米材料作为细胞支架开展心肌组织工程研究取得明显进展.碳纳米管材料具有良好的力学性能和导电特性,前期研究表明,其具有促进新生鼠心肌细胞中未成熟心肌细胞增殖与成熟心肌细胞进一步发育的作用,但尚未见碳纳米管材料对棕色脂肪来源的心脏干细胞(CSCs)生物学特性影响的研究报道.为此,本研究首先采用凝胶-溶胶法制备了羧基化多壁碳纳米管和聚甲基丙烯酸甲酯(MWNTs/PMMA)薄膜,并通过一系列细胞学、免疫细胞化学及电镜检测方法,系统评价了MWNTs/PMMA薄膜对大鼠棕色脂肪CSCs活力、增殖能力及向心肌分化效率的影响.研究发现,与明胶材料相比,MWNTs/PMMA薄膜对棕色脂肪CSCs活力、增殖能力有明显促进作用,并且明显增强其向心肌细胞分化的能力,分化的心肌细胞具有明显可见的肌管结构,并且表达介导细胞间电化学传导的缝隙连接蛋白connexin43.此外,超微结构观察发现碳纳米管与细胞膜间及细胞与细胞之间可直接形成紧密连接,调控细胞行为.本研究首次探讨了碳纳米管导电材料对棕色脂肪CSCs生物学特性影响的规律,证实碳纳米管导电材料具有良好的促心肌细胞分化作用.作为一种新型导电纳米材料,碳纳米管在心肌组织工程研究中具有良好的应用前景,未来有望在心肌组织体外构建及心肌梗死治疗性应用中发挥潜在的价值.

MicroRNA-20a通过调节CKIP-1促进小鼠C3H/10T1/2成骨分化

目的:研究microRNA-20a(miR-20a)对小鼠C3H/10T1/2细胞成骨分化作用的影响及其调控机制。方法:对贴壁培养的小鼠C3H/10T1/2细胞成骨诱导不同时间,ALP染色及应用qRT-PCR验证其诱导结果,同时观察MiR-20a在诱导过程中表达变化;细胞转染MiR-20a mimics,CKIP-1 siRNA,在荧光显微镜下观察转染效果,应用qRT-PCR测定过表达及干扰效率;qRT-PCR检测过表达MiR-20a及干扰CKIP-1对细胞成骨分化的影响及过表达MiR-20a对CKIP-1基因表达的影响。结果:成骨标记基因ALP、OSX、OCN、BSP随小鼠C3H/10T1/2细胞诱导过程逐渐升高,且成骨诱导分化过程中MiR-20a表达上调。过表达MiR-20a促进C3H/10T1/2细胞成骨分化,成骨标记基因碱性磷酸酶(ALP)、RUNX2、OSX、0CN、BSP显著高于对照组,并且抑制CKIP-1的表达;干扰CKIP-1能促进细胞成骨标记基因表达。结论:MiR-20a可能通过下调骨形成负调节因子CKIP-1的表达促进C3H/10T1/2细胞成骨分化。

富勒醇对基于悬滴培养的脂肪间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨富勒醇对基于悬滴培养的大鼠脂肪间充质干细胞(r ADSCs)向成骨细胞分化的影响。方法将rADSCs通过悬滴培养3d形成大鼠脂肪间充质干细胞球,将细胞球用胰酶消化分散成单细胞,对获得的单细胞进行二维贴壁培养24h,然后更换为成骨诱导培养基培养,其中未添加富勒醇组为对照组,添加1.0μmol/L富勒醇组为实验组,诱导分化14d及21d后利用茜素红染色和实时定量PCR检测脂肪干细胞球来源的单细胞向成骨细胞分化的能力。结果悬滴培养3d的rADSCs可形成大小均一的微球结构,经胰酶消化分散可获得细胞球来源的单细胞。与对照组相比,在成骨诱导培养基中添加1.0μmol/L富勒醇可使所获单细胞形成更多的矿化的钙结节,且相关成骨基因Runx2、OCN、ColⅠ的表达增强。结论富勒醇可以显著增强基于悬滴培养获得的rADSCs的成骨分化,有助于提高其成骨诱导的效率。

纳米银溶胶的体外细胞毒性评价及其机制研究

目的对纳米银溶胶的体外细胞毒性进行评价，初步探讨纳米银对细胞的毒性作用机制。方法利用化学还原法制备纳米银溶胶，通过紫外一可见分光光度计和透射电镜对其物理特性进行检测；以小鼠纤维肉瘤细胞（L929）为研究对象，通过细胞形态观察、LIVE／DEAD染色分析和MTT检测来评价纳米银对细胞的毒性作用；在电子显微镜下观察纳米银在细胞中的分布，探讨纳米银对细胞的毒性作用机制。结果当纳米银质量浓度大于10mg／L时会对L929细胞产生明显的细胞毒性，细胞形态发生明显变化，细胞增殖受到抑制。纳米银可以通过胞吞作用进入细胞，与细胞内的多种细胞器相互作用而造成细胞损伤。结论纳米银会对哺乳动物细胞的形态和存活产生影响且具有浓度依赖性，因此在纳米银的应用过程中要考虑其毒副作用。

两种肝脏全器官脱细胞基质制备方法的比较

目的对两种肝脏全器官脱细胞基质制备方法进行比较,为筛选更为有效的制备方法提供依据。方法选取两种脱细胞方案[分别以十二烷基硫酸钠(SDS)和Triton X-100+SDS(Tx+SDS)为主要洗涤剂]制备肝脏全器官脱细胞基质,制备完成后进行三维形态、脉管结构及组织学、免疫荧光染色观察,并对脱细胞基质中的DNA残留量、胶原含量及生长因子[肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]含量进行检测。结果两种方法均成功制备出肝脏全器官脱细胞基质。组织学和DNA含量检测显示两种方案均可成功移除细胞和细胞核组分,保留细胞外基质(ECM)蛋白;Tx+SDS方案可以维持肝脏的天然脉管结构,而SDS方案则会损坏脉管结构;与SDS方案比较,Tx+SDS方案能保留更多的ECM蛋白成分(7.76±0.15μg/mg vs 4.23±0.05μg/mg),更多的HGF含量(44.5±2.9ng/g vs 11.3±1.8ng/g)和bFGF含量(15.9±0.4ng/g vs 6.1±0.7ng/g)。结论以Tx+SDS为主要洗涤剂的脱细胞方法成功制备出了较好的肝脏全器官脱细胞基质,可为肝组织工程和再生医学提供优良的支架材料。

基于微电极阵列的多通道电生理检测系统的研制

设计并制备出一套低成本的微电极阵列及多通道电生理检测系统。通过基本的光刻、腐蚀对ITO导电玻璃进行加工,制备带有电极图形的导电玻璃,复合一层绝缘层后获得微电极阵列。利用软件设计PCB电路图并委托公司加工,获得相关系统的硬件部分。在labVIEW平台下进行编程,满足对数据采集卡的操作。我们成功制备了一套低成本的微电极阵列及相关检测系统。该系统用于不同类型神经细胞组成的神经网络自发放电检测,可在体外培养的神经网络中检测到5μV的神经信号,并在神经网络发育14 d检测到密集的同步簇发动作电位。我们研发的微电极阵列及多通道电生理检测系统具有良好的性能,可用于不同类型神经细胞的神经网络微弱信号的检测与神经网络发育研究。

基于心脏全器官脱细胞基质的组织工程支架材料制备与生物学评价

目的探讨一种心脏全器官脱细胞方法,并对制备的心脏脱细胞基质支架进行检测与评价。方法通过联合使用胰蛋白酶、Triton X-100等洗涤剂,对成年SD大鼠离体心脏进行主动脉逆行灌流脱细胞处理。对制备的心脏脱细胞基质支架进行大体观察、甲苯胺蓝灌流染色、HE染色、扫描电镜观察、阿利新蓝染色、细胞外基质组分免疫组织化学染色等观察。结果成功制备心脏全器官脱细胞基质支架材料,其保留了原心脏的大体形态;HE染色、甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察显示其保留了较好的脉管结构与超微空间构象;阿利新蓝染色及免疫组织化学染色结果显示,其主要的细胞外基质成分,包括Ⅰ型胶原、糖氨聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白保留良好。结论制备的大鼠心脏脱细胞基质支架保留了心脏原有的结构与细胞外基质成分,有望作为全器官心脏体外再造的良好组织工程支架材料。