生物反应器内再造组织工程化心肌的实验研究

目的在体外模拟微重力条件下构建心肌细胞-胶原复合体,探索组织工程化心肌组织体外再造的可行性。方法采用顺序消化及差速贴壁法从1～2d龄新生大鼠的心肌组织中分离心肌细胞,并将其与多孔胶原复合形成复合体。复合体在旋转生物反应器(rotarycellculturesystem,RCCS)中进行培养,观测复合体内心肌细胞的生长状况、超微结构、细胞代谢率及细胞组分的变化,并将其与正常心肌和常规培养的复合体进行比较。结果在RCCS中培养的复合体内的细胞具有心肌细胞的特殊超微结构,免疫组化显示其中的α-横纹肌肌动蛋白染色呈强阳性,与静止培养的复合体细胞相比,细胞代谢更加旺盛。结论采用组织工程技术可以在RCCS中培育出组织工程化心肌组织。

骨髓间质干细胞复合多孔磷酸钙陶瓷修复兔颅骨缺损的研究

目的 探讨以骨髓间质干细胞 (MSCs)作为种子细胞、β-磷酸三钙 (β- TCP)多孔生物陶瓷作为支架材料构建组织工程化人工骨 ,修复兔实验性颅骨标准缺损的可行性。 方法 选择 5月龄新西兰大白兔 34只 ,制作颅骨标准缺损后分成 3组。A组 (n=2 0 ) :分离培养兔同胎异体 MSCs,体外扩增后接种到预制的 β- TCP多孔生物陶瓷材料上 ,细胞 -材料复合体经体外孵育后 ,无菌条件下植入颅骨缺损 ;B组 (n=10 ) :采用单纯β- TCP材料修复兔颅骨缺损 ;C组(n=4 ) :兔实验性颅骨标准缺损区未做骨修复。术后 6周和 12周分别处死动物、取材 ,进行缺损区大体、组织学、组织化学和免疫组织化学分析。 结果 颅骨缺损处 A组术后 6周表面肉眼可见骨样组织形成 ,组织学提示材料部分降解 ,未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生骨组织 ,成骨细胞外基质丰富 , 型胶原染色阳性 ;术后 12周 ,支架材料几乎完全降解 ,缺损区被新生骨组织所取代。B组术后 6周 ,可见从缺损区边缘有新生骨组织向支架材料内长入 ,支架材料部分吸收 ;术后 12周 ,可见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生骨组织逐渐增多 ,但材料的中心部位未发现新生骨形成。C组术后 12周 ,仅见少量骨组织从缺损区边缘向缺损区内长入 ,缺损中央大部分区域未得到修复。

骨髓间质干细胞复合生物陶瓷构建组织工程化人工软骨

目的 探索以多孔β-磷酸三钙 (β- TCP)生物陶瓷材料为支架 ,经体外诱导的骨髓间质干细胞 (MSCs)为种子细胞 ,构建组织工程化软骨修复羊关节软骨缺损的可行性。方法 将 2 8只中国美利奴绵羊分为三组。实验组 (n=12 ) :分离培养羊自体第 7代 MSCs,经转化生长因子 - β诱导后接种到预制的 β- TCP多孔生物陶瓷材料上 ,细胞 -材料复合体经体外孵育后 ,无菌条件下植入预制的羊单侧肱骨近端关节面缺损处 ;单纯材料组 (n=12 ) :采用单纯β- TCP材料修复羊关节软骨缺损 ;空白对照组 (n=4 ) :制备的羊关节软骨缺损区未做任何修复。术后 12周和 2 4周分别取材 ,进行组织学、组织化学和免疫组织化学分析。结果 实验组术后 12周羊关节软骨缺损处肉眼可见透明软骨样组织形成 ,组织学检查发现 ,材料降解明显 ,未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生软骨组织 ,软骨细胞外基质丰富 , 型胶原染色阳性 ;术后 2 4周 ,支架材料几乎完全降解 ,缺损区被新生软骨组织所取代。单纯材料组术后 12周 ,缺损区边缘有新生软骨组织向支架材料内长入 ,支架材料吸收明显 ;术后 2 4周 ,见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生软骨组织逐渐增多 ,但材料的中心部位未发现新生软骨形成。空白对照组至术后 2 4周 。

体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的初步研究

目的 :5 -氮胞苷作为分化诱导剂 ,初步探讨其单独或联合全反式维甲酸应用时对小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为心肌细胞的影响 ,旨在建立一种体外诱导mESC分化为心肌细胞的实验方法。方法 :采用MTT法确定 5 -氮胞苷的非细胞毒性参考剂量。设计不同条件培养基 (5 -氮胞苷单独或配伍全反式维甲酸应用 )对mESC进行诱导分化 ,并通过免疫组化技术及RT -PCR方法等对分化细胞进行鉴定。结果 :5 -氮胞苷的非细胞毒性参考剂量为 8μmol/L ,能够诱导mESC分化为心肌合胞体 (与阴性对照组比较 ,P <0 0 1) ,诱导分化率可达 5 0 %。配伍全反式维甲酸持续诱导的结果等同于单独应用全反式维甲酸的作用效果 (P >0 0 5 ) :即对ESC向心肌细胞的诱导分化没有促进作用。结论 :5 -氮胞苷能够诱导mESC分化为心肌合胞体 ,从而得以建立一种体外诱导mESC分化为心肌细胞的方法。

应用旋转生物反应器批量制备拟胚体的研究

以小鼠胚胎干细胞(ES-D3)为模型,应用新型细胞培养系统--STLV型旋转生物反应器(rotary cell culture system,RCCS)建立一种批量制备拟胚体(embryoid bodies,EBs)的新方法,研究不同细胞接种密度及培养时间对RCCS内EBs产生效率的影响.为了进一步研究该制备方法是否对EBs的分化潜能产生影响,对照传统方法制备的EBs,利用形态学及RT-PCR方法测定经旋转生物反应器制备的EBs在自发性或诱导条件下(1%DMSO)向心肌细胞的分化能力.结果表明:ES-D3在RCCS内能够高效形成EBs,与传统的直接悬浮法比较,其EBs的形成效率可达到后者的2倍.1×104个/ml为最佳细胞接种密度,培养时间也是在RCCS制备EBs过程中的重要因素之一,培养第4～5天为最佳收获EBs的时间.与悬滴法制备的EBs比较,该方法制备的EBs分化为心肌细胞的潜能未改变.由此,应用旋转生物反应器可以高效制备EBs,该方法制备的EBs可以用于发育生物学等基础及应用领域的相关研究.

大鼠脂肪干细胞的分离培养及基本生物学性状研究

目的：探讨体外分离培养大鼠脂肪干细胞（ADSC）的方法,并研究其基本生物学特性,为可注射的组织工程化心肌治疗心肌梗死提供种子细胞来源。方法：体外分离培养大鼠脂肪来源的干细胞并进行传代培养,流式细胞术鉴定CD90、CD29、CD34及CD45的表达及检测细胞周期;绘制ADSC的生长曲线;通过细胞形态观察、特异性染色来检测脂肪干细胞向成骨、成脂肪细胞分化的能力。结果：大鼠ADSC表型特征为CD90、CD29阳性,CD34、CD45阴性;ADSC能连续传代达15代以上,且在第7代仍保持较强的增殖能力。流式细胞术显示各代次的ADSC约80%左右处于细胞周期的G0-G1期。ADSC具有向成骨、成脂肪细胞分化的潜能。结论：大鼠脂肪干细胞增殖能力强,具有向成骨、成脂肪细胞分化的潜能,第7代之前的细胞可作为组织工程的种子细胞来源。

胰岛移植及胰岛干细胞研究进展

本文综述了近年来胰岛移植相关研究的进展,包括胰岛的分离、纯化、培养、冷冻保存和免疫隔离;同时还介绍了胰岛组织干细胞以及诱导胚胎干细胞分化为胰岛的最新进展,在对胰岛移植治疗糖尿病的现状及研究发展趋势进行全面分析的基础上,笔者认为异体胰岛移植是当前I型糖尿病治疗的重要手段之一,而胰岛干细胞移植则是未来糖尿病治疗的趋势。

海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸微囊植入大鼠体内的生物相容性的实验研究

研究海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸(BPA)微囊在大鼠体内的生物相容性。用静电微囊发生仪制备BPA微囊,将4mL空微囊分别注射于20只Sprague-Dawley大鼠腹腔内,于1、2、4、8周各取5只大鼠,处死后用生理盐水灌洗腹腔,收集灌洗液,待微囊全部沉淀后,计算其中空微囊数并观察微囊的形态改变。结果表明:移植后1、2、4、8周从大鼠腹腔内取出的微囊95%～98%为完整、圆形、表面光滑、无明显的结缔组织包绕。说明我们所制作的BPA微囊具有较好的生物相容性。

采用组织工程技术在裸鼠体内再造膀胱组织结构的研究

目的 探讨应用组织工程的方法在裸鼠体内再造膀胱的可行性。方法 体外分离、培养、扩增犬的膀胱移行上皮细胞和平滑肌细胞 ,分别接种于预制成囊样结构的聚乳酸 聚羟乙酸(PLGA)聚合物支架材料的内、外两侧表面 ,形成细胞 支架材料复合体 ,体外 37℃培育 48h后植入到裸鼠背部皮下 ,2 0、40和 6 0d时分别取材 ,进行组织学和免疫组织化学分析。结果 细胞 支架复合体经体内培育 2 0～ 6 0d ,在外观上形成了与支架材料形状基本一致的新生组织 ,组织学和免疫组织化学分析结果表明 ,其外壁由多层的平滑肌细胞构成 ,内壁由数层移形上皮细胞层构成 ,在组织结构上类似于正常膀胱壁。结论 在裸鼠体内构建了具有膀胱结构基本特征的膀胱器官 ,提示采用组织工程技术构建膀胱器官是可行的。

二甲基亚砜诱导胚胎干细胞分化伴随凋亡发生

目的:标准化二甲基亚砜(DMSO)诱导胚胎干细胞(ESC)向心肌细胞分化的方法,及DMSO是否同时诱导细胞凋亡。方法:MTT法确定DMSO的应用剂量,不同条件培养基对ESC进行诱导分化,并在形态学、蛋白质及基因水平鉴定ESC源心肌细胞。利用形态学、流式细胞仪等对细胞凋亡进行观测。结果:DMSO的最佳应用浓度为1％,拟胚体经诱导后跳动率为96．7％。该心肌细胞表达多种心肌蛋白,且肌小节结构发育成熟。DMSO的促分化效应可能与心肌转录因子GATA-4的表达有关,1％ DMSO可诱导ESC部分产生凋亡,且具有时间和剂量依赖性。结论:1％DMSO不但能够高效诱导ES-D3分化为心肌细胞,且以时间依赖的方式诱导ES-D3细胞部分凋亡。

海藻酸钠胰岛素纳米粒对糖尿病大鼠的降血糖作用

目的研究海藻酸钠胰岛素纳米粒的制备方法及其对糖尿病大鼠的降血糖作用。方法采用离子交联法制备海藻酸钠胰岛素纳米粒,分别用透射电镜和纳米粒度分析仪测定纳米粒形态和粒径。建立Wistar大鼠糖尿病模型,观察海藻酸钠胰岛素纳米粒灌胃给药后的降血糖作用。结果制备得到的纳米粒形态为球形或近球形,粒径为236.4±19.3nm,胰岛素包封率为78.5%±6.1%,载药量为22.6%±4.4%。降血糖试验表明,海藻酸钠胰岛素纳米粒灌胃(26U/kg)后7h,血糖含量开始下降,这种降血糖作用可维持12h,其中血糖维持在正常水平的时间可达6h(血糖值≤7.0mmol/L)。结论海藻酸钠胰岛素纳米粒具有一定的缓释功能,灌胃给药后可降低糖尿病大鼠血糖水平。

Dextran分离纯化大鼠胰岛的生物学特性

目的探讨一种分离纯化大鼠胰岛的方法，并评价该法分离得到的胰岛的生物学特性。方法常规外科手术分离胰腺。然后将其剪为lrnm3左右碎块，置于0．9mg／ml胶原酶V37℃振荡消化10～17min，以含10％胎牛血清的Hank’s液终止消化。60目筛网过滤。DextranT40非连续密度梯度离心纯化胰岛。纯化后的胰岛经DTZ染色，吖啶橙／碘化丙啶（AO／PI）染色、放射免疫分析检测胰岛素分泌量，纯化后的胰岛进行异种移植，检测降糖效果。结果胰岛分布于11％Dextran和1640及11％和22％Dextran界面之间，平均每只Wistar大鼠消化后可获得2181士14个胰岛，纯化后回收1826±24个胰岛，胰岛收获量达（85．7±5．9）％，纯度高达95％以上。胰岛对葡萄糖刺激有良好的反应性，纯化后胰岛异种移植，可逆转实验性糖尿病SD大鼠血糖7～10天。结论胶原酶消化，Dextran T40纯化是一种简单、高效的胰岛分离纯化方法，获得的胰岛有良好的生物学特性。

模拟微重力条件下大鼠胰岛培养及体内移植的实验研究

目的研究经模拟微重力条件培养的胰岛是否能够降低胰岛移植过程中引发的免疫排斥反应,进而延长胰岛的体内存活时间。方法分离新鲜胰岛,应用培养皿对胰岛进行静态培养,同时应用旋转式生物反应器对胰岛进行三维立体培养。应用吖啶橙-碘化丙啶(AO-PI)染色和葡萄糖刺激实验对3种条件下培养得到的胰岛进行生物学活性研究。2000当量胰岛在旋转式生物反应器中培养5d后,将其移植入经链脲佐菌素(STZ)处理的糖尿病模型SD大鼠肾被膜下作为实验组,以新鲜分离的胰岛和静态培养5d的胰岛移植入经STZ处理的糖尿病模型SD大鼠肾被膜下作为对照组。在不同时间点上,检测各组SD大鼠血糖变化情况;对各移植组中大鼠进行糖耐受实验。切除肾被膜下的移植物组织作为标本,进行苏木精-伊红(HE)染色及胰岛素组织化学染色检测。结果体外检测结果表明,与新鲜分离的胰岛和静态培养的胰岛相比,微重力条件下培养的胰岛仍保持良好的胰岛素合成及分泌功能。体内实验表明,微重力条件下培养的胰岛体内移植组的血糖保持正常的时间明显高于接受静态培养的胰岛和新鲜分离的胰岛移植组。将微重力培养条件下胰岛移植大鼠后,取肾被膜下移植区组织标本进行HE染色,未见明显淋巴细胞浸润,胰岛素免疫组织化学均可见阳性细胞。而新分离的胰岛以及静态培养的胰岛移植后,大鼠肾被膜下移植物组织标本可见淋巴细胞浸润,移植物的厚度明显变小。结论胰岛在微重力条件下培养可降低移植引起的免疫排斥反应,进而延长移植物体内存活时间。

采用Percoll非连续密度梯度离心法纯化大鼠乳鼠心室肌细胞

目的 探索从心室肌组织中纯化心肌细胞的方法。方法 用胰蛋白酶消化大鼠乳鼠心室肌组织 ,获得细胞悬液经Percoll分离 ,通过光镜和免疫组织化学方法对获得的每层细胞进行分析 ,采用免疫组织化学和激光共聚焦方法鉴定心肌细胞。结果 Percoll分离后 ,细胞分为 6层 ,每层细胞培养 3d时 ,通过光镜和免疫组织化学观察发现心肌细胞富集在第 4、5两层。富集的心肌细胞第 3天形成细胞簇或细胞单层 ,收缩明显而有力。心肌细胞可维持良好的形态和活力达 2～ 3个月。结论 使用Percoll分离法可以从大鼠乳鼠心室肌组织中纯化心肌细胞。

成人骨髓基质干细胞的分离与纯化

目的利用免疫磁珠分离成人骨髓神经生长因子受体(nervegrowthfactorreceptor,NGFR)阳性细胞,获得同质性骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)。方法采用Percoll密度梯度离心法分离成人骨髓中单个核细胞(mononuclearcells,MNCs)。对MNCs进行常规贴壁培养或应用磁分离技术分离NGFR+细胞。分别检测NGFR+细胞和常规贴壁培养所获BMSCs体外扩增和集落形成能力,分析其细胞表型和细胞周期,并进行成骨、成脂肪诱导。结果免疫磁珠分离获得NGFR+细胞的纯度为(90.4±4.7)%,NGFR+细胞较贴壁培养获得BMSCs具备更强增殖能力和成骨及成脂肪分化潜能。结论利用免疫磁珠分离骨髓NGFR+细胞可以获得同质性原始BMSCs。

纤维蛋白胶联合干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死

目的探讨纤维蛋白胶联合大鼠脂肪干细胞（ADSCs）移植于梗死心肌后的细胞存活及对心功能的影响。方法分离培养大鼠脂肪干细胞（ADSCs），流式细胞术鉴定其表型。将雌性SD大鼠左冠状动脉前降支结扎建立心肌梗死模型，模型建立1周后，存活大鼠随机（随机数字法）分成4组，即对照组（n=10）、纤维蛋白胶组（n=10）、细胞组（n=10）及联合组（n=10）。于梗死边缘区分别移植100μl PBS、纤维蛋白胶和4，6二乙酰基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2．phenylindole DAPI）标记的100μl ADSCs，联合组用纤维蛋白胶加ADSCs注射。移植后4周，用血流动力学评估心功能，后处死动物取心肌标本，测量心肌梗死面积；用DAPI、肌节辅肌动蛋白免疫组化双染法确定细胞的存活；Ⅷ因子染色法检测血管新生。数据用SPSS15．0统计软件统计分析（多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用成组t检验）。以P〈0．05为差异具有统计学意义。结果细胞移植后4周，联合组的LVSP，＋dp／dtmax均高于其他三组（P〈0．05）。联合组心肌梗死面积（28．5±3．6）％明显低于细胞组（33．33±2．3）％和纤维蛋白胶组（35．96±2．11）％，（均P〈0．05）。联合组梗死区的毛细血管密度（108．7±11．38／mm^2）显著高于细胞组、纤维蛋白胶组和对照组（均P〈0．01）。用DAPI、肌节辅肌动蛋白免疫组化双染法示联合组心肌梗死区的存活细胞数量多于单纯细胞移植组。结论纤维蛋白胶联合ADSCs移植可以提高细胞的存活并显著改善大鼠心肌梗死后的心功能。

血管紧张素Ⅱ2型受体重组腺病毒的扩增及其在INS-1细胞中的转染

目的利用人胚肾(HEK)293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和对照病毒Ad-CMV-EGFP,并测定病毒滴度。在INS-1细胞中瞬时转染后利用实时PCR、Western印迹以及免疫荧光和激光共聚焦技术检测细胞中AT2R与AT1R的表达。结果扩增后得到重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP的滴度分别为9×109和8×109pfu/ml。在INS-1细胞中转染Ad-GAT2R-EGFP后,AT2R mRNA的表达随病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)值的增加呈剂量依赖性增加。当MOI值为10时,AT2R mRNA的表达达到峰值(P<0.05),同时AT2R蛋白的表达明显高于转染了Ad-CMV-EGFP的细胞和未转染细胞,但AT1R的表达无显著变化。结论成功扩增并得到高滴度且携带有AT2R基因的重组腺病毒载体,并将其转染入INS-1细胞中构建出AT2R高表达的胰岛β细胞模型,为下一步探讨AT2R在胰岛β细胞中的作用奠定了基础。