普氏立克次体120kDa表面抗原N端和C端重组蛋白的抗原特异性研究

免疫印迹分析证明N端重组蛋白和C端重组蛋白均能与普氏立克次体免疫血清特异反应,N端重组蛋白仅与立氏立克次体免疫血清发生交叉反应,C端重组蛋白则与立克次体属的立氏立克次体和莫氏立克次体免疫血清发生交叉反应.用ELISA分析重组蛋白与各种相关病原体免疫血清的交叉反应,发现N端重组蛋白和C端重组蛋白与立克次体属内的立克次体免疫血清有较强的交叉反应,但是与贝氏柯克斯体、恙虫病东方体以及其它病原体免疫血清无交叉反应,提示N端重组蛋白和C端重组蛋白具有立克次体属特异性.……

普氏立克次体120 kDa表面抗原N端和C端重组蛋白的免疫原性研究

将普氏立克次体全细胞抗原和120kDa表面蛋白的N端和C端重组蛋白进行纯化,将纯化后的重组蛋白分别免疫小鼠和家兔.酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验分析免疫动物血清特异性IgG,发现N端和C端重组蛋白均能有效地诱导小鼠和家兔产生较高水平的特异性IgG,C端重组蛋白刺激小鼠和家兔产生的特异性IgG水平比N端重组蛋白刺激后的特异性IgG水平高.对免疫动物的脾脏细胞作体外淋巴细胞增殖试验发现N端和C端重组蛋白均能诱导较高水平的脾淋巴细胞增殖.对免疫小鼠作足垫肿胀试验,C端重组蛋白比N端重组蛋白诱导更明显的特异性迟发型变态反应.采用RT-PCR方法检测全细胞抗原免疫小鼠脾淋巴细胞被不同抗原刺激后的细胞因子的表达,发现两个重组蛋白刺激的小鼠脾淋巴细胞均表达了IFN-γ和IL-2两种细胞因子,说明它们可以促使THO细胞向TH1细胞分化.本研究结果证明120kDa表面蛋白的N端和C端重组蛋白均具有良好的特异性体液免疫和细胞免疫原性,可以作为流行性斑疹伤寒亚单位疫苗的候选蛋白.……

普氏立克次体120 kDa表面抗原N端和C端基因的克隆与表达

采用PCR方法,从普氏立克次体基因组中扩增出120kDa表面抗原的N端和C端基因片断,并将其克隆于原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30/N和pQE30/C,将重组质粒转入大肠杆菌M1 5,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达.SDS-PAGE分析发现两重组质粒转化菌分别产生了一26kDa(N端)和67kDa(C端)重组蛋白;在免疫印迹分析中,26kDa和67kDa重组蛋白均与普氏立克次体免疫血清发生特异反应,证明27kDa和67kDa重组蛋白分别为120kDa表面抗原的N端和C端重组蛋白,具有普氏立克次体120kDa表面抗原特性.……

贝氏柯克斯体在鸡胚中生长繁殖的研究

研究贝氏柯克斯体在鸡胚中的生长繁殖特征,以便获得大量的贝氏柯克斯体全细胞抗原.将5个贝氏柯克斯体感染鸡胚卵黄膜用5ml无菌肉汤研磨,取一定量的菌液倍比稀释成四个浓度,分别接种四组7日令鸡胚(每组12个),0.3ml/枚,35℃孵育培养,找出最佳接种剂量进行大量鸡胚接种,繁殖贝氏柯克斯体.①1:160浓度接种后,大多数鸡胚集中在第8天死亡外,其它各组大部分鸡胚死亡在接种后的3-5天;鸡胚卵黄膜涂片染色后显微镜下检查,发现第7、8天死亡的鸡胚中贝氏柯克斯体的量明显高于接种后3～5天中死亡的鸡胚.②选择1:160菌液浓度,0.3ml/枚的量,分别接种90枚、194枚、142枚、149枚鸡胚,绝大部分鸡胚在接种后7～10天内死亡,用它们的卵黄囊膜涂片,染色镜检均发现大量的贝氏柯克斯体.从感染贝氏柯克斯体后第8天左右死亡的鸡胚中可获得最佳的贝氏柯克斯体繁殖量.……

贝氏柯克斯体特异的PCR检测实验感染小鼠

用10 ID50的贝氏柯克斯体新桥株感染Balb/c小鼠,感染后第2、3、4、5、7、14、21、28天分别解剖小鼠取脾脏提取DNA,用贝氏柯克斯体特异的套式PCR对脾脏DNA样本做PCR扩增.结果从感染第5和7天的小鼠脾脏DNA样本中扩出明显的贝氏柯克斯体特异DNA带(阳性),而从第3和14天的脾脏DNA样本中扩增目的DNA为弱阳性,其它时间获得的脾脏DNA样本中均未检出特异DNA带(阴性).检测结果提示感染早期立克次体进入小鼠脾脏繁殖,在感染后的5～7天达到高峰,而14天后脾脏贝氏柯克斯体的量显著减少;研究结果证明该套式PCR具有很高的特异性和敏感性,可用于贝氏柯克斯体感染的早期诊断.……

贝氏柯克斯体34×103重组外膜蛋白的免疫保护性的研究

原核细胞表达贝氏柯克斯体34×103外膜蛋白基因,评价34×103重组外膜蛋白的免疫保护性.用PCR从我国贝氏柯克斯体分离株的基因组中扩增34×103外膜蛋白基因,用该基因与原核表达质粒重组,构建重组表达质粒;用IPTG诱导重组质粒在大肠杆菌细胞内表达重组蛋白.用重组蛋白皮下接种免疫BALB/c小鼠2次,在加强免疫后的第28天,用ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平以及作体外脾淋巴细胞增殖试验检查小鼠的特异性细胞免疫水平;用10ID50贝氏柯克斯体腹腔注射攻击免疫小鼠,攻击后第7天病理学检查小鼠脏器的组织病变和染色镜检脾脏的贝氏柯克斯体量.SDS-PAGE和免疫印迹分析证明重组质粒转化的大肠杆菌产生了34×103重组蛋白,重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清发生特异性反应.ELISA法检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组蛋白抗体,免疫小鼠的体外淋巴细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.组织病理学检查发现免疫小鼠的肺、肝、脾无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏肿大并含有大量的柯克斯体.重组34×103外膜蛋白具有的免疫保护性,能够诱导机体产生有效的抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答.……

贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因表达及重组外膜蛋白免疫保护性的研究

研制贝氏柯克斯体30kDa重组外膜蛋白和分析该重组蛋白的免疫保护作用.将克隆贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因与原核表达载体pQE30重组,用重组质粒转化大肠杆菌后用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠2次,用IFA和ELISA检查免疫小鼠的特异性抗体,以及用重组蛋白体外刺激小鼠T淋巴细胞增殖;免疫4周后,用柯克斯体毒株攻击免疫小鼠,攻毒后第7d,小鼠的主要脏器作病理学检查和柯克斯体量测定.(1)贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌细胞内表达,产生的重组蛋白约占全菌蛋白的14.6%,免疫印迹显示该重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应.(2)ELISA检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组外膜蛋白抗体,免疫小鼠的脾淋巴细胞经重组外膜蛋白刺激后,细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.(3)免疫小鼠的肺、肝、脾,无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏明显肿大并含有大量的柯克斯体.贝氏柯克斯30kDa重组外膜蛋白诱导小鼠产生抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答能有效地抵御贝氏柯克斯体的感染.……

恙虫病东方体Karp株重组蛋白的免疫原性和免疫保护性的初步研究

对恙虫病东方体Karp株的47kDa和56kDa重组外膜蛋白、58kDa重组热休克蛋白、56kDa与47kDa(56-47)和58kDa与47kDa(58-47)双抗原融合蛋白的免疫原性和免疫保护性进行评价.……

贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR方法的建立

采用新型TaqMan-MGB探针建立贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR检测方法.根据贝氏柯克斯体特异的23S插入序列设计引物和探针,将PCR扩增的插入序列连接到T载体质粒,该重组质粒用作参比模板来建立方法.用建立的实时荧光定量PCR检测倍比稀释的参比模板,其敏感性是套式PCR检测方法的1000倍.用其它立克次体的DNA作对照模板,该定量PCR显示高度贝氏柯克斯体特异性.用建立的实时荧光定量PCR检测感染小鼠脏器样本,在小鼠的脾脏、肝脏样本中检测到贝氏柯克斯体,检测到的贝氏柯克斯体的量与感染的过程有线性关系.本研究建立的贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR检测方法具有比普通PCR检测方法更好的特异性和更高的敏感性,其定量检测的特性特别适合对贝氏柯克斯体感染程度的评价,以及对Q热疫苗的免疫保护效果的评价.……

表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗构建

构建能够表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗.用PCR技术从卡介苗(BCG)基因组扩增分支杆菌19kDa抗原的细胞壁结合区基因和从贝氏柯克斯体基因组扩增27kDa外膜蛋白基因,将它们分别插入大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒(pSMT3)的XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/HindⅢ位点.将重组的穿梭质粒转化大肠杆菌和从大肠杆菌提取重组穿梭质粒转化卡介苗.从含潮霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性重组卡介苗菌落,用免疫印迹分析重组质粒转化的卡介苗,发现一约27kD的蛋白带与贝氏柯克斯体27kD重组蛋白免疫兔血清特异反应,用27kD重组蛋白免疫兔血清做间接免疫荧光检测重组卡介苗,结果为阳性.重组卡介苗能表达贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白,表达的27kDa外膜蛋白存在卡介苗菌体表面,卡介苗菌体表面的27kD抗原可能有效地诱导特异性的抗Q热免疫应答.……

恙虫病东方体58kDa热休克蛋白与47kDa外膜蛋白的基因嵌合及58-47嵌合基因在大肠杆菌中表达

采用PCR方法,从恙虫病东方体Karp株基因组DNA中扩增58kDa热休克蛋白的基因,将该基因分别与原核表达载体pQE30及47kDa外膜蛋白的基因重组质粒(pQE30/47)连接,构建pQE30/58及pQE30/58-47重组质粒,用重组质粒转化大肠杆菌.SDS-PAGE显示,pQE30/58和pQE30/58-47转化的大肠杆菌分别产生一58kDa重组蛋白和一90kDa的双抗原(58-47)融合蛋白.免疫印迹分析显示Karp株免疫血清能特异识别58kDa重组蛋白和90kDa融合蛋白,90kDa融合蛋白既与47kDa重组蛋白也与58kDa重组蛋白的免疫血清特异反应,58kDa与47kDa重组蛋白也被90kDa融合蛋白免疫血清所识别.研究结果证明58-47融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株47kDa外膜蛋白和58kDa热休克蛋白的抗原特性.……