组织型纤溶酶原激活物基因的DNA改组

目的:探索利用DNA改组(DNA shuffling)技术,获得更高活性tPA的可能性。方法:以人、恒河猴及大白鼠tPA cDNA为一组基因,进行tPA的DNA改组(DNA family shuffling)。以改组后构建的tPA多样性文库转染CHO细胞并进行克隆和筛选。结果:得到了两株有意义的克隆:t9和t17,其中t9克隆表达的tPA活性略高于人tPA,初步的比活性测定结果表明,活性约提高4倍。t17克隆表达的tPA虽然有88个氨基酸的缺失,但仍表现出与人tPA相同的活性。两株克隆经测序证明,为改组后的基因,其序列以人和恒河猴的tPA cDNA序列为主,少数序列来源于大白鼠tPA cDNA。结论:这一探索性结果将为后续几轮的tPA DNA改组探明道路,为最终从改 组后tPA多样性基因库中筛选到比较理想的重组体打下基础。

人血管生成素-1基因的克隆及表达载体的构建

【目的】克隆人血管生成素 1基因 ,并构建原核、真核表达载体。【方法】提取人骨髓中的总RNA ,反转录成cDNA ,利用巢式PCR技术扩出人血管生成素 1基因片段 ,并克隆到PQE 31、B7载体中。【结果】克隆了正确的人血管生成素 1基因 ,构建了PQE31Ang 1、B7Ang 1载体。【结论】人血管生成素 - 1基因的克隆及表达载体的构建 ,为进一步研究其功能、活性和应用奠定了基础。

应用随机PCR技术制备靶基因文库随机片段

目的 用随机PCR技术制备构建靶基因文库的随机基因片段。方法 先扩出靶基因 (HIV1Envgp160 )片段 ,然后设计两条引物 ,1条为锚定随机引物用于扩出靶基因的随机片段 ,另 1条为锚定特异引物用于对随机片段进行扩增 ,得到大量的随机片段 ;优化模板量、dNTP浓度、反应时间、温度和DNA聚合酶等反应条件 ,扩出靶基因的随机片段。结果 得到用于建库的理想靶基因随机片段。结论 随机PCR是制备靶基因文库随机片段的一个简便有效方法。

人血管生成素-1原核表达载体的构建与表达

目的 构建人血管生成素 - 1的原核表达载体 ,并进行表达。方法 利用PCR技术扩出人血管生成素 - 1基因片段 ,并克隆到PQE - 31载体中 ,转化E .coliM 15菌株后进行诱导表达。结果 构建了PQE31Ang - 1原核表达载体 ,在M 15中进行了高效表达。结论 通过原核表达得到人血管生成素 - 1蛋白 ,其具有良好的抗原性 。

基因修饰的骨髓间充质干细胞移植于慢性心肌梗死模型的实验研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)165基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植于慢性心肌梗死模型后的血管新生及对心功能的作用。方法同源重组法构建含有 VEGF_(165)基因的重组腺病毒载体(rAd-VEGF_(165));密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,贴壁法培养兔 MSCs;rAd-VFGF_(165)转染 MSCs,并用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记 MSCs;结扎前降支法建立兔心肌梗死模型,存活6周的实验动物36只随机分为3组:移植 rAd-VFGF_(165)转染的 MSCs 组(Ⅰ组)12只、单纯移植 MSCs 组(Ⅱ组)12只和只注射无血清培养基的对照组(Ⅲ组)12只。移植术后4周,超声法检测心脏功能,并同术前比较;荧光显微镜下观察 MSCs 分布情况;免疫组化法检测梗死区微血管密度。结果移植4周后Ⅰ组的 MSCs 存活率大于其他2组;Ⅰ组的左室射血分数、E/A 比值和梗死区微_血管密度与其他2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 VEGF_(165)基因和 MSCs 联合策略是治疗心肌梗死的有效方法,所产生的协同治疗效果大于单纯的 MSCs 移植。