用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究

目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆。检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+。将表达质粒pA FRTHFLF和pOG44以1∶9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+。转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测。筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆。在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其最后的表达量为5mg/L。对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Westernblot和抗原结合活性的检测。结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L。结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础?

细胞内抗体应用的研究进展

细胞内抗体是近几年发展起来的具有良好应用前景的抗体工程领域 ,是指在细胞内表达并被定位于亚细胞区室 (如胞核、胞浆或某些细胞器 ) ,与特定的靶分子作用 (干扰或阻断靶分子的加工、分泌或功能 )从而发挥其生物学功能的一类新的工程抗体。主要应用在抑制病毒复制特别是HIV 1复制、肿瘤基因治疗方面 ,已经逐渐拓展到中枢神经系统疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等领域 。

重组人血清白蛋白-干扰素α-2b 融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒活性评价

目的检测重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法构建含1.6倍HBV基因组及绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP-HBV),感染人肝细胞系HepG2细胞,构建HBV复制细胞模型;ELISA法检测HBV乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)表达;MTT法检测HSA-IFNα-2b对HepG2细胞的毒性作用;定量PCR法检测细胞内HBV RNA的相对表达以及细胞上清中HBV DNA绝对表达水平;双报告基因法检测HSA-IFNα-2b对HBV增强子Ⅰ活性的影响。结果 AdGFP-HBV感染HepG2细胞后可以复制表达HBV。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1加入AdGFP-HBV感染的HepG2细胞,使HBsAg表达降低51.32%(P<0.01),HBeAg降低50.26%(P<0.01),而相同浓度的HSA-IFNα-2b并不抑制细胞的增殖。随HSA-IFNα-2b浓度增加,其对HBsAg表达的抑制作用逐渐升高,HSA-IFNα-2b对HBsAg表达的抑制率(Y)与其浓度(X)的回归方程是Y=21.11 lgX+11.91(r2=0.954),IC50为63.76 kU·L-1。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使细胞中HBV RNA下降52.83%(P<0.01),培养上清中HBV DNA降低53.07%(P<0.01)。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使HBV增强子Ⅰ活性下降40.04%(P<0.01)。结论构建了可用于药物评价的HBV复制细胞模型,HSA-IFNα-2b体外具有抗HBV活性。

丙型肝炎病毒NS5ab区的B细胞模拟表位的确认

目的 用噬菌体展示随机肽库研究丙型肝炎病毒 (HCV)NS5ab区的B细胞表位。方法 在原核系统中表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,亲和层析纯化血清中抗HCVNS5ab的特异多抗 ,用此多抗来筛选噬菌体递呈随机 12肽库 ,获得HCVNS5ab区的B细胞表位。结果 成功地表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,用此蛋白检验了 130份HCV阳性血清 ,阳性率为 36 %。在筛选的噬菌体展示随机肽库后 ,挑取 13个阳性克隆测序 ,有 9个序列不同 ,最终通过噬菌体表位表达的方法确认了 3个表位。

HSA-sTRAIL融合蛋白的表达质粒pPICZαA-HSA-sTRAIL的构建

目的:构建pPICZαA-HSA-sTRAIL真核表达质粒。方法:用PCR方法扩增sTRAIL基因,然后克隆入pPICZαA载体,构建pPICZαA-sTRAIL质粒,然后将HSA基因克隆入pPICZαA-sTRAIL质粒,构建pPICZαA-HSA-sTRAIL真核表达质粒。重组子均进行酶切鉴定和PCR鉴定,最后进行DNA测序验证。结果:PCR方法克隆出目的基因,并成功构建了pPICZαA-HSA-sTRAIL质粒。酶切鉴定、PCR鉴定和DNA测序均证明构建的表达质粒完全与预期一致。结论:成功构建了pPICZαA-HSA-sTRAIL真核表达质粒。

急性肿瘤溶解综合征

急性肿瘤溶解综合征(ATLS)为肿瘤治疗过程中的一种严重并发症,主要表现为高尿酸血症、高钾血症和高磷血症,易并发低钙血症、酸中毒及肾功能衰竭,病死率较高。现综述急性肿瘤溶解综合征的病理生理机制、影响急性肿瘤溶解综合征的发生因素、临床表现以及预防、治疗和预后等方面的最新研究进展。

TAT-HBX-EGFP融合蛋白的表达、纯化及在小鼠肝脏内的跨膜分布

目的高效表达TAT—HBX—EGFP融合蛋白，研究其在小鼠肝脏内的分布。方法构建TAT-HBX—EGFP重组载体，IPTG诱导使其在BL21中大量表达；蛋白经Ni柱纯化后注射入小鼠体内，免疫荧光观察TAT，HBX—EGFP融合蛋白在小鼠肝脏的分布。结果TAT，HBX—EGFP在大肠埃希菌中获得高效表达；HBX蛋白可以在TAT的引导下进入小鼠肝脏。结论TAT引导肽可以将HBX蛋白引导至小鼠肝脏。

携带人肝细胞生长因子腺病毒重组体的构建

目的构建一种同时携带人肝细胞生长因子(hHGF)及绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒重组体,为hHGF的基因治疗提供实验基础。方法对重组质粒pcDNA3-hHGF进行酶切鉴定及测序正确后,酶切获得hHGF,亚克隆至带有GFP标记的穿梭质粒pAdTrack-CMV上。选取hHGF正向插入的重组穿梭质粒经PmeⅠ充分线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,挑取阳性克隆行PCR及酶切鉴定。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,脂质体转染HEK293细胞进行包装并扩增获取重组病毒上清,RT-PCR及WesternBlot方法检测hHGF的表达。结果目的基因的测序结果与Genebank上的hHGF序列一致。hHGF基因插入重组腺病毒载体的预期位置,感染Ad-hHGF的HEK293细胞中可检测到hHGFmRNA和蛋白的表达。结论成功构建了同时携带hHGF和GFP的重组腺病毒表达载体Ad-hHGF,为进一步探讨hHGF的生物学功能提供了实验依据。