重组人血清白蛋白-干扰素α-2b 融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒活性评价

目的检测重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法构建含1.6倍HBV基因组及绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP-HBV),感染人肝细胞系HepG2细胞,构建HBV复制细胞模型;ELISA法检测HBV乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)表达;MTT法检测HSA-IFNα-2b对HepG2细胞的毒性作用;定量PCR法检测细胞内HBV RNA的相对表达以及细胞上清中HBV DNA绝对表达水平;双报告基因法检测HSA-IFNα-2b对HBV增强子Ⅰ活性的影响。结果 AdGFP-HBV感染HepG2细胞后可以复制表达HBV。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1加入AdGFP-HBV感染的HepG2细胞,使HBsAg表达降低51.32%(P<0.01),HBeAg降低50.26%(P<0.01),而相同浓度的HSA-IFNα-2b并不抑制细胞的增殖。随HSA-IFNα-2b浓度增加,其对HBsAg表达的抑制作用逐渐升高,HSA-IFNα-2b对HBsAg表达的抑制率(Y)与其浓度(X)的回归方程是Y=21.11 lgX+11.91(r2=0.954),IC50为63.76 kU·L-1。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使细胞中HBV RNA下降52.83%(P<0.01),培养上清中HBV DNA降低53.07%(P<0.01)。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使HBV增强子Ⅰ活性下降40.04%(P<0.01)。结论构建了可用于药物评价的HBV复制细胞模型,HSA-IFNα-2b体外具有抗HBV活性。

TAT-HBX-EGFP融合蛋白的表达、纯化及在小鼠肝脏内的跨膜分布

目的高效表达TAT—HBX—EGFP融合蛋白，研究其在小鼠肝脏内的分布。方法构建TAT-HBX—EGFP重组载体，IPTG诱导使其在BL21中大量表达；蛋白经Ni柱纯化后注射入小鼠体内，免疫荧光观察TAT，HBX—EGFP融合蛋白在小鼠肝脏的分布。结果TAT，HBX—EGFP在大肠埃希菌中获得高效表达；HBX蛋白可以在TAT的引导下进入小鼠肝脏。结论TAT引导肽可以将HBX蛋白引导至小鼠肝脏。

携带人肝细胞生长因子腺病毒重组体的构建

目的构建一种同时携带人肝细胞生长因子(hHGF)及绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒重组体,为hHGF的基因治疗提供实验基础。方法对重组质粒pcDNA3-hHGF进行酶切鉴定及测序正确后,酶切获得hHGF,亚克隆至带有GFP标记的穿梭质粒pAdTrack-CMV上。选取hHGF正向插入的重组穿梭质粒经PmeⅠ充分线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,挑取阳性克隆行PCR及酶切鉴定。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,脂质体转染HEK293细胞进行包装并扩增获取重组病毒上清,RT-PCR及WesternBlot方法检测hHGF的表达。结果目的基因的测序结果与Genebank上的hHGF序列一致。hHGF基因插入重组腺病毒载体的预期位置,感染Ad-hHGF的HEK293细胞中可检测到hHGFmRNA和蛋白的表达。结论成功构建了同时携带hHGF和GFP的重组腺病毒表达载体Ad-hHGF,为进一步探讨hHGF的生物学功能提供了实验依据。