我国斑点热立克次体感染与免疫的实验研究

研究证明黑龙江立克次体能够感染人血管内皮细胞和BALB/c小鼠,引起小鼠菌血症和器官损伤;全基因组序列分析发现黑龙江立克次体毒力相关基因。表面蛋白质组分析鉴定了黑龙江立克次体和立氏立克次体的表面蛋白,用表面蛋白免疫C3H/HeN小鼠,发现某些表面蛋白为保护性抗原,并揭示这些保护性抗原均能够诱导抗原特异CD4+和CD8+T细胞增殖并产生和分泌IFN-γ和/或TNF-α,以及诱导高水平特异性IgG2a产生,在这些免疫因素的协同作用下使小鼠有效抵抗立克次体感染。用黑龙江立克次体感染Tim-3高表达或低表达人血管内皮细胞以及Tim-3高表达转基因小鼠,结果有力证明Tim-3高表达能够促进人血管内皮细胞和小鼠抵抗黑龙江立克次体感染。

Q热疫苗研究

Q热(Q fever)为一种世界性分布的重要人兽共患病,疫苗接种是预防Q热的最有效手段。专性细胞内寄生的贝氏柯克斯体是Q热的病原体,灭活I相贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)免疫保护效能几乎为100%,但是其免疫副反应强。氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体(CMR)和三氯醋酸提取贝氏柯克斯体可溶性抗原(TCA)Q热疫苗保留灭活Q热疫苗的免疫保护效能,且免疫副反应显著减轻。但CMR和TCA Q热疫苗均需要用鸡胚大量培养贝氏柯克斯体,需要在高等级生物防护实验室采用复杂步骤提取、纯化贝氏柯克斯体,这些使Q热疫苗的生产成本高、批量生产难。近十年来,国内外Q热疫苗研究着力于分子疫苗,并已经由研究贝氏柯克斯体保护性抗原转移到筛选能诱导特异性细胞免疫应答的CD4+和CD8+T细胞表位上,以期望T细胞表位在机体内高效表达,诱导机体产生良好的抗Q热保护性免疫应答。

大黄抑制鼠疫耶尔森菌的体外转录组学研究

目的应用鼠疫菌全基因组芯片研究大黄抑制鼠疫菌的分子作用机制。方法液体稀释法测定大黄对鼠疫菌的最低抑菌浓度(MIC),以10倍MIC作用鼠疫菌30min,提取鼠疫菌总RNA,逆转录合成cDNA,荧光素标记,与芯片杂交,扫描仪扫描,应用SAM软件分析结果。结果获得了大黄作用鼠疫菌的表达谱。大黄作用鼠疫菌的明显差异基因为498个,其中上调基因358个,下调140个。结论蛋白质合成基因、细胞膜相关基因、转运结合蛋白基因以及部分热休克基因的改变是大黄抑制鼠疫菌的主要作用机制。

东北三省蠓科小志

目的调查研究我国东北三省蠓科昆虫的种类分布。方法采用人帐诱、诱虫灯诱、动物诱和网捕法采集蠓类。结果在东北三省31市县采获蠓类650 000余只,计4亚科14属140种,细蠓亚科1属1种,毛蠓亚科1属9种,铗蠓亚科3属27种,蠓亚科9属103种;吸血蠓3属91种。辽宁省已知4亚科6属56种,分布在23市县;吉林省已知2亚科3属44种,分布在10市县;黑龙江省已知3亚科13属100种,分布在21市县。结论这一研究结果为我国东北三省蠓科昆虫的区系分布研究提供了科学依据。

不同动物(血)对蚊虫的引诱作用

目的比较不同动物及动物血液对蚊虫的引诱作用,探讨蚊虫对动物宿主的嗜血习性。方法以不同动物血液引诱实验室饲养的蚊虫,以不同动物进行野外现场引诱蚊虫实验。结果实验室内淡色库蚊对猪血的吸血率最高,为51%,其他依次为人血、狗血、绵羊血和牛血;白纹伊蚊对牛血吸血率最高,为47%,其他依次为绵羊血、狗血、人血和猪血;埃及伊蚊对牛血吸血率也最高,为44%,其他依次为狗血、绵羊血、人血和猪血。现场实验表明家鸡对淡色库蚊引诱力较强,共诱集到1420只,其他依次为肉鸽、麻雀和大白鼠;家鸡对白纹伊蚊引诱力较强,共诱集到11只,其他依次为大白鼠、肉鸽和麻雀。结论淡色库蚊嗜吸猪血,白纹伊蚊、埃及伊蚊嗜吸牛血;家鸡对淡色库蚊的引诱效果较好。

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3'UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3'UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3'UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3'UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3'UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。

普氏立克次体重组表面蛋白制备和免疫印迹抗原特异性分析

目的克隆与表达普氏立克次体(Rickettesia prowazekii)主要蛋白抗原基因,分析所表达重组蛋白的抗原特异性。方法采用PCR法从普氏立克次体全基因组中扩增其主要抗原基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒;将基因重组表达质粒转化大肠杆菌,用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白。将普氏立克次体、莫氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、贝氏柯克斯体等实验感染小鼠血清与重组蛋白做免疫印迹。结果经过PCR扩增后获得9个目的基因片段,用其构建出9个原核表达质粒;9个原核表达质粒转化菌均高效表达出相应的重组蛋白;结果显示FtsZ、GroEL、Rp828、EF-Ts等4个蛋白特异性最好,仅与普氏立克次体感染小鼠血清反应;其次是Omp,它除与普氏立克次体感染小鼠血清反应外,仅与莫氏立克次体感染血清反应。结论 FtsZ等4个重组蛋白为普氏立克次体的特异性抗原,可以作为研制流行性斑疹伤寒血清学诊断试剂的候选抗原。

贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析

目的使用贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白作为包被抗原的酶联免疫吸附试验用于血清学检测的特异性和敏感性分析。方法本研究建立由贝氏柯克斯体的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组表面蛋白抗原分别包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,然后分别检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清和Q热患者血清中IgG特异性抗体。结果 8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL反应为阴性外其它均为阳性;11份Q热患者血清中除1份血清与RplL、1份血清与OmpH反应为阴性外,其它血清反应均为阳性。将这5种重组蛋白分别与莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清反应,除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外,其它血清反应均为阴性。另外,Com1对斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者血清的阳性反应率平均为22.2%,GroEL为25.0%,Mip为25.0%,OmpH为25.0%,RplL为13.9%。结论这些结果证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别。所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性,可用作Q热血清学诊断。

促进CHO细胞生长及其产物hNGF表达的培养条件的初步研究

以稳定表达人神经生长因子(hNGF)的重组工程CHO细胞株为对象,采用无血清流加悬浮培养(Fed-batch culture)方式,考察使用基础培养基(无特殊添加物),分别添加丁酸钠、DMSO、KH2PO4的培养基及不同培养温度(32℃和37℃)对细胞生长和重组蛋白表达的影响。每日取样检测细胞密度、细胞活率、葡萄糖浓度、重组蛋白浓度。结果表明细胞培养温度由37℃下降至32℃,细胞生长周期明显延长,重组蛋白产量增加。5mmol/L丁酸钠和2%DMSO的加入虽然提高了重组蛋白的表达量,但严重抑制细胞生长。最大的蛋白比生成速率(qNGF)出现在37℃培养且添加2%DMSO的培养条件下,而最高蛋白表达量则出现于32℃培养添加3.65mmol/LKH2PO4的培养条件下。研究表明,将培养温度设为32℃,在基础培养基中添加3.65mmol/LKH2PO4或1%DMSO是提高hNGF表达水平的有效方法。

高致病性人禽流感H5N1透皮疫苗免疫佐剂的初步筛选

用不同的佐剂与高致病性人禽流感H5N1全病毒疫苗混合,通过透皮途径免疫BALB/c小鼠并评价其免疫应答效果,从而初步筛选出较好的透皮免疫佐剂。实验选用CT、CpG ODN1826、CpG ODN2006、MF59四种不同的佐剂按适当的比例与高致病性人禽流感H5N1灭活全病毒抗原混合制成透皮疫苗,透皮免疫BALB/c小鼠,检测血清IgG抗体效价、血清中和抗体效价,以及肺、鼻灌洗液中特异性IgG和IgA抗体效价,并对脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4细胞因子水平进行评估。结果显示,在CpG ODN1826单独使用或与CT合用组血清IgG抗体效价较无佐剂组均有显著升高(P<0.05),其中尤以CpG1826+CT+HA组血清IgG抗体效价最高,同时血清中和抗体效价也验证了这一点,肺、鼻灌洗液中,均可检测到特异性IgA、IgG。佐剂组与无佐剂组、PBS组、空白对照组相比较,脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的水平均见提高(P<0.05),并且CpG1826+CT+HA组与滴鼻组相比无统计学意义(P=0.2267)。结果表明,在高致病性人禽流感H5N1病毒透皮疫苗的小鼠模型中,CT与CpG ODN1826是较好的的透皮免疫佐剂,能够诱导机体Th2型和Th1型免疫应答,同时诱导了黏膜免疫应答的产生,这为进一步研究提供了基础。