分子生物学在空气微生物气溶胶研究中的应用进展

空气微生物气溶胶的研究方法很多,包括培养计数法、生物发光法、化学发光法、直接镜检法、免疫学方法、分子标志法、生物传感器和分子生物学方法(基因探针和PCR法)。分子生物学方法由于特异性强、操作简便、快速,尤其是最新发展的定量PCR的方法还可以实现对DNA或RNA的绝对定量分析,因此在空气微生物气溶胶的研究中有很好的发展前景。本文对应用PCR和实时定量PCR(QPCR)在空气微生物气溶胶领域的研究进行了综述,指出了传统PCR和QPCR的优缺点,着重对QPCR在空气微生物领域的应用进行了比较全面的分析,指出了应用QPCR检测空气微生物气溶胶还应解决的问题和前景。

几种高效过滤器材对微生物气溶胶防护效果的评价

目的评价滤毒罐、高效滤材和高效过滤器等微生物气溶胶防护装备的防护效果。方法采用本所新建微生物气溶胶检测评价技术平台对上述防护装备阻留微生物气溶胶的效果进行了测试。结果滤毒罐对粘质沙雷菌气溶胶滤除率为99.9％～100％，高效滤材对该气溶胶滤除率100％，高效过滤器对该气溶胶滤除率为91％～96％。某医院实际使用的高效滤器对粘质沙雷菌气溶胶滤除率波动在97％～100％。结论所测试的几种高效过滤防护装备对粘质沙雷菌气溶胶的滤除效果波动在91％～100％，不同单位研制生产的高效过滤装备防护效果差异较大，但滤毒罐和高效滤材滤除率达到99．99％和100％。

个人防护装备高效过滤罐微生物气溶胶防护效果的检测及评价

为了测试个人防护装备中使用的高效过滤罐的微生物气溶胶过滤效率,本研究以粘质沙雷氏菌8039为指示微生物,在实验室中发生气溶胶,分别采集过滤前后的空气样本,根据培养长出的菌落数计算过滤效率。在对该生物防护装备对微生物气溶胶的防护效果做出评价的同时为相应国家标准的建立提供数据资料。

微生物全基因组测序组装中的gap填补方法

目的:研究和开发高通量测序全基因组组装过程中的填补gap的方法。方法:研究组装软件的算法,使用Perl语言编写自动填补gap的程序,并建立全基因组组装的流程。结果:提出了填补gap的末端延伸法,并使用Perl语言进行了编程;在对立克次体高通量测序的组装过程中,这些方法能大大减少gap的数量。结论:本研究提出的末端延伸法能够高效填补全序列组装过程中出现的gap,具有很强的实用性。

用粘质沙雷菌试验评价Ⅱ级生物安全柜的研究

目的改进完善Ⅱ级生物安全柜生物测试的方法,观察两种指示微生物的空气生物学特性。方法采用改良美国NF-49标准方法,以粘质沙雷菌为指标菌检测生物安全柜防护性能。结果枯草杆菌黑色变种芽孢经过porton采样器冲击30 m in,其相对存活率只有37%;而粘质沙雷菌经30 m in冲击,其相对存活率为88%。枯草杆菌黑色变种芽孢经30 m in雾化,其相对存活率为53%;粘质沙雷菌雾化30 m in,其相对存活率为89%。实验环境中粘质沙雷菌本底检测结果菌落数均为0,粘质沙雷菌在自然界空气中不是优势菌株,不会对检测产生干扰。两台生物安全柜在不同风速下防护性能检测结果全部合格且与该安全柜出厂检测结果一致。结论粘质沙雷菌具有良好的雾化和冲击耐受性,受检的安全柜的人员、样品和环境防护作用合格,本研究建立的检测验证方法灵敏性和重复性与美国标准(NF-49)一致。

生物安全柜的使用选择和生物防护性能检测及评价

目的:通过介绍各种类型生物安全柜的特点以及检测,实现对安全柜的正确评价和使用。方法:按照标准中规定的方法,使用微生物气溶胶进行评价,测试了正常标称风速下及增大污染机会的情况下的人员保护、产品保护和交叉污染。结果:每次测试阳性对照培养皿>300cfu。人员保护测试评价每次全部撞击式采样器的采样菌落数不大于10cfu,所有狭缝采样器的采样菌落数不大于5cfu。产品保护实验中所有培养皿上的枯草芽孢杆菌数不大于5cfu。交叉污染实验中距被检测侧壁36cm外的培养皿上的菌落数不大于2cfu。结论:本次测试的Ⅱ级B2型安全柜生物防护性能型式测试符合标准的要求。

病原微生物实验室Ⅱ级生物安全柜防护性能评价

目的评价病原微生物实验室Ⅱ级生物安全柜的防护性能。方法采用安德森采样器采样方法和通过相关仪器,以粘质沙雷菌气溶胶为防护对象进行Ⅱ级生物安全柜防护性能评价。结果所评价的36台Ⅱ级生物安全柜下降气流的平均合格率为91.7%,流入气流合格率为43.7%,气流模型合格率为43.9%。人员保护合格率为72.2%,样品保护合格率为88.9%,交叉污染合格率为88.9%。结论所测试的Ⅱ级生物安全柜存在较大的气溶胶泄漏风险,对实验操作人员保护性能较差。

生物安全柜更换过滤器后防护性能的评价

目的测试与评价生物安全柜更换高效过滤器后对操作人员保护、产品保护和交叉污染的防护性能。方法制备枯草芽孢气溶胶发生液,按照标准中规定的测试方法,对安全柜的3种生物学评价指标,即人员保护、产品保护和交叉污染的防护性能进行测试,3种测试分别重复3次。结果3次测试中,人员保护每次6个液体撞击式采样器的枯草芽孢杆菌培养菌落数之和不超过10 cfu,2个固体采样器的培养菌落数之和不超过5 cfu。产品保护每次所有培养皿上的枯草芽孢杆菌落数不超过5 cfu。交叉污染每次测试中被检测侧壁36 cm外的所有培养皿上的枯草芽孢杆菌菌落数不超过2 cfu。结论该安全柜更换过滤器后,人员保护、产品保护和交叉污染的防护性能均良好,符合标准的要求。

ⅡA2型生物安全柜对病毒气溶胶的防护效果

目的测试与评价二级生物安全柜对病毒气溶胶的防护效果,为该生物安全柜的安全使用提供依据。方法发生噬菌体phiX 174气溶胶,按照标准中规定的测试方法就安全柜的物理学评价指标及3种生物学评价指标即人员保护、交叉污染和产品保护进行测试,3种测试分别重复3次。结果 3次测试中,人员保护每次6个液体撞击式采样器的培养噬菌斑数之和不大于10 pfu,2个裂隙采样器的培养噬菌斑数之和不超过5 pfu。产品保护每次所有培养皿上的phiX174噬菌斑数不超过5 pfu。每次交叉污染测试中被检测侧壁36 cm外的所有培养皿上的噬菌斑数不超过2 pfu。结论该生物安全柜对病毒气溶胶的防护效果符合标准的要求。

病原微生物实验室实验操作产生气溶胶风险定量研究

目的使用指示细菌、病毒代替有传染性的细菌、病毒,研究实验操作产生的微生物气溶胶风险,为相关实验室活动的风险评估提供科学数据。方法负压实验室内用高浓度指示细菌和病毒(噬菌体)进行实验室中多种实验操作产生的气溶胶风险,包括高浓度吹吸混匀、高浓度培养瓶意外跌落、离心管破裂产生的气溶胶风险实验。安德森六级采样器主动采样和沉降平皿被动采样两种方法进行微生物气溶胶采样。根据采样结果得到各种实验操作产生的气溶胶风险。结果在模拟的各种正常和意外事故的实验室操作中,在模拟测试条件下高浓度气溶胶吹吸在局部环境中产生的细菌气溶胶风险最高浓度为1174菌落形成单位(CFU)/m^3、病毒气溶胶最高浓度为1058噬斑形成单位(PFU)/m^3,高浓度培养瓶破碎产生的细菌气溶胶风险最高浓度为7957 CFU/m^3、病毒为7942PFU/m^3,离心管破裂时产生的细菌气溶胶风险最高浓度为80 CFU/m^3、病毒为78 PFU/m^3。结论病原微生物实验操作中存在着产生很高微生物气溶胶的风险。实验人员要遵守操作规程,选择合适的防护装备。

病原微生物实验室实验操作对室内空气产生微生物污染的研究

目的通过模拟病原微生物实验室实验操作产生的微生物气溶胶,对实验室产生微生物污染风险进行定量研究,为实验操作人员危害评估和防护措施提供科学依据。方法使用黏质沙雷菌作为指示细菌,在实验室内对多种实验操作如吹吸混匀、培养瓶意外跌落、正常离心、离心管破裂、注射攻毒、解剖动物和安全柜泄漏等进行正常操作和意外事故模拟,使用定量空气采样和沉降平皿的方法对各种操作造成的微生物气溶胶风险进行定量分析。结果在本实验条件下,局部环境产生的微生物气溶胶浓度差异较大。吹吸混匀、培养瓶意外跌落、正常离心、离心管破裂、注射攻毒、解剖动物和安全柜泄漏产生的最大源强分别为1409、9346、<10、138、>8232、<4和>801 CFU/m3。结论病原微生物实验室各种实验操作产生的气溶胶源强差异较大,在局部环境中可以产生较高的气溶胶污染,应加强实验技能的培训和一级呼吸道防护装备的应用。

生物恐怖袭击事件特点及其医学应对处置能力建设

通过对生物武器危害及生物袭击事件的剖析,阐述了生物恐怖袭击相关的概念、袭击途径,应当关注的生物剂种类、袭击事件类型及其应对处置的要点,提出了只有加强监测察觉、检验确认、调查评估能力建设,准备必要预案和特需药材物资,才能建设好生物袭击事件的医学应对处置能力的基本观点。

猪链球菌2型溶血素的纯化及生物学活性研究

目的:摸索天然和重组猪链球菌2型溶血素的纯化工艺,评价制备蛋白的生物学活性。方法:天然猪溶血素的纯化采用硫酸铵沉淀,阴离子交换层析和疏水层析制备,重组猪溶血素采用镍柱亲和层析进行柱上变复性后,用Th iolproyl-sepharose 6B进一步亲和纯化。通过溶血实验,细胞毒性测定实验评价纯化蛋白的活性。结果:制备的天然和重组猪溶血素纯度均在90%以上,具有较高的溶血活性,较高浓度时能损伤靶细胞,胆固醇能够完全封闭其活性。结论:制备获得的重组猪溶素与天然蛋白具有相近的生物学活性,为进一步研究猪链球菌2型溶血素在猪链球菌致病机制方面的作用奠定了基础。

国境口岸输入性虫媒传染病及媒介生物风险分析和风险管理系统研究：风险分析

为在口岸传染病防控方面探索新的思路和方法，建立科学的风险评估机制，采用澳大利亚和新西兰联合开发的风险管理标准，对境外的虫媒传染病及其媒介生物传人我国口岸的风险建立评估方法和体系。结果显示，通过对国际国内传染病疫情进行有效评估，分析传染病传播模式和趋势，确定输入输出风险等级和主要防控环节，及时发出预警信息，然后有针对性地在重点地区口岸和重点环节采取措施，能够有效控制媒介生物以及携带病原体的传播。引入风险分析理论，建立风险评估机制，对有效减少传染病疫情所带来的危害，保障我国口岸公共卫生安全十分必要。

LFn-MAGE3融合蛋白表达及生物学功能初步研究

目的:表达融合蛋白LFn-MAGE3,探讨无毒炭疽毒素用于治疗肿瘤的可能性。方法:将LFn的编码序列导入PET21a表达载体中,构建LFn融合表达载体PET21a-LFn。将全长MAGE-3基因插LFn融合表达载体中,构建了PET21a-LFn-MAGE3融合蛋白表达载体。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达LFn-MAGE3融合蛋白。表达产物用QsepharoseFF离子交换柱和PheHP疏水柱进行纯化。LF毒性抑制实验和细胞免疫荧光实验检测融合蛋白的生物学活性。结果:融合蛋白LFn-MAGE3在大肠杆菌BL21a获得胞内可溶性表达,经纯化后,获得一定纯度的LFn-MAGE3融合蛋白。细胞免疫荧光实验显示LFn-MAGE3能在PA(炭疽保护性抗原)协同下高效进入巨噬细胞。结论:表达纯化获得的LFn-MAGE3融合蛋白能在PA协助高效进入细胞,可以用于下一步的肿瘤免疫治疗的动物实验中。

德国小蠊聚集信息素生物合成调控因子的研究

用气相色谱仪检测德国小蠊体表提取物中聚集信息素各组分的相对含量,研究脑因子和光周期对聚集信息素生物合成的影响,结果表明德国小蠊的头部并不存在促进信息素合成的昆虫信息素合成激活肽(PBAN)类因子;不同的光照条件对聚集信息素的合成有明显影响,一直处于黑暗中,只是偶尔打破黑暗的条件最适合德国小蠊聚集信息素的合成,而在连续黑暗或长时间的光照的条件下均会明显抑制聚集信息素的生物合成。

2006年广州登革热病原体的分离鉴定及其生物学性质的观察

目的:对2006年广州流行登革热病原进行分离鉴定及生物学性质研究。方法:采用传代蚊细胞微量培养方法对2006年广州登革热病原进行分离,并通过脑内途径观察其对乳鼠的致病性;经间接免疫荧光和RT-PCR技术,对患者血清标本中的病毒特异抗体及新分离的病原体进行检测和鉴定;将此次分离的病原体与1980年分离的同型毒株进行生物学性质比较。结果:从57份患者血清标本中分离出10株病毒,在传代蚊细胞中可产生稳定的细胞病变并对乳鼠致病;其基因组为登革1型病毒特异的RNA分子,经鉴定为登革1型病毒;此次分离的登革1型病毒与1980年分离的同型毒株在致细胞产生病变的时间和严重程度,蚀斑的大小、形态以及致乳鼠发病的时间等生物学性质上有所不同。结论:2006年广州流行登革热病原为登革1型病毒,且与1980年分离的同型毒株在生物学性质方面存在明显差异。

基于裂解酶与ATP生物发光法特异定量检测炭疽杆菌方法的研究

目的:原核表达炭疽杆菌噬菌体γ裂解酶(PlyG)和萤光素酶(Luc),结合这2种酶建立特异定量检测炭疽杆菌的方法。方法:PCR扩增得到带有His标签的裂解酶基因和萤光素酶基因,构建重组表达载体pET22b-plyG和pET22b-luc,转化至大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,过镍柱纯化得到目的蛋白;利用裂解酶裂解和ATP生物发光定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1,与平板计数法对比建立线性关系。结果:表达了炭疽杆菌噬菌体γ裂解酶和萤光素酶,并建立了特异定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1的方法,与平板计数方法具有显著的线性相关。结论:因炭疽杆菌与蜡样芽孢杆菌RSVF1均对PlyG具有较强的敏感性,故本研究所建立的将炭疽杆菌噬菌体γ裂解酶与萤光素-萤光素酶系统相结合的检测方法对现场或临床定性定量检测炭疽杆菌提供了理论支持,具有良好的应用前景。

常见高致病性病原微生物环境安全临界值研究

目的开展常见病原微生物环境安全参考标准值研究,为高等级生物安全实验室(BSL)环境风险评估提供依据。方法以微生物危害度评估方法为基本原则,结合人体暴露剂量计算方法,提出人体经呼吸对病原微生物暴露的感染剂量的计算模型。在总结国内外常见病原微生物特性研究成果的基础上,通过模型计算,获得常见病原微生物环境安全临界值参考标准以及环境风险防护距离。结果提出常见高致病性病原微生物环境风险评价标准计算方法,研究得出SARS冠状病毒、高致病性禽流感病毒、结核分枝杆菌、炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉热弗朗西丝菌、流行性出血热病毒等7种常见病原微生物的最小感染剂量,以及不同环境风险对应的环境安全临界值。结论所提出的环境安全临界值可作为高等级BSL感染性气溶胶的环境风险评估参考标准,用于实验室风险控制与应急管理。

多耐药鲍曼不动杆菌噬菌体IME-AB6的分离、生物特性及保存方法研究

目的:分离并鉴定一株多耐药鲍曼不动杆菌噬菌体,对其生物特性进行研究,为治疗多耐药鲍曼不动杆菌感染提供新的方法和实验依据。方法:以一株多耐药不动杆菌AB6为宿主菌,从医院废水中分离出噬菌体;用聚乙二醇6000对噬菌体进行浓缩和纯化,并就噬菌体的形态、一步生长曲线、裂解特性和不同保存条件对噬菌体活性的影响进行初步研究。结果:分离出一株噬菌体IME-AB6,电镜显示为肌尾噬菌体,其潜伏期为10 min,爆发期为40 min,爆发量160 pfu/cell;IME-AB6能迅速使菌液变清晰,温度灵敏性强,并且发现在4℃保存是一种方便高效的方法。结论:噬菌体IME-AB6是一株新的有独特特点的噬菌体,用聚乙二醇能很好地提高滴度,其潜伏期和爆发期短且杀菌效能强,性能稳定易保存,这对于噬菌体制剂的开发和耐药性鲍曼不动杆菌的防治具有潜在应用价值。