悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的实验研究

利用5L生物反应器悬浮培养HEK-293N3S细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（recombinant adenovirus-greenfluorescent protein,Ad-GFP）,为规模化生产腺病毒基因药物建立一种稳定可行的生产工艺。复苏的种子细胞进行逐级放大最后接入5L搅拌式生物反应器中,采用含5%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培基灌流培养293N3S细胞,当细胞密度达到（2-4）×10^6个/mL时感染Ad-GFP,48h后收获细胞,经两步氯化铯超速离心获得纯化的Ad-GFP。采用紫外分光光度计比色法和高压液相色谱法（HPLC）测定病毒颗粒数和纯度,采用组织培养半数感染剂量（TCID50）法检测腺病毒的感染滴度。连续培养10-12d,细胞密度可达到（2-4）×106个/mL左右,纯化的Ad-GFP感染滴度和颗粒数分别为1.0×10^11IU/mL和1.68×10^12VP/mL,比活性为6.0%,A260/A280比值为1.33,产品纯度达到99.2%。建立了5L生物反应器悬浮培养293N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的生产工艺,对携带其他基因的重组腺病毒药物生产具有一定的指导意义。

肝细胞生长因子与皮肤创面修复

皮肤创面修复是一个复杂的生物学过程，其中包括炎症反应、细胞增殖、胶原代谢、毛囊形成和色素沉积等病理生理过程。许多生长因子介导和调控伤口的纤维化、血管生成和再上皮化，在皮肤愈合过程中发挥作用。其中，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）作为一种高效的多功能生长因子，具有促进皮肤创伤愈合和毛囊再生。抑制病理性瘢痕形成和皮肤色素沉着等重要作用。本文就HGF在皮肤创伤修复中的作用及机制做如下综述。

MiR-486通过调控Sirt1调节TF-1细胞的糖代谢

目的:探索低氧条件下造血细胞miR-486表达变化及miR-486对造血细胞糖代谢的调控作用及机制。方法:利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法检测低氧条件下TF-1细胞miR-486及Sirt1的表达水平。用慢病毒技术将miR-486过表达或沉默后检测Sirt1、葡萄糖转运因子1(glucose transporter 1,Glut1)和葡萄糖转运因子4(glucose transporter 4,Glut4)的表达水平。另外,将Sirt1沉默后分别用qRT-PCR及Western blot检测Sirt1的表达,并用qRT-PCR检测Glut1和Glut4的表达水平。结果:低氧促进miR-486的表达并抑制Sirt1的表达;过表达miR-486导致Sirt1的表达下调,而沉默miR-486可以促进Sirt1的表达;过表达miR-486上调Glut1和Glut4的表达,而沉默miR-486则抑制Glut1和Glut4的表达;沉默Sirt1可以促进Glut1和Glut4的表达。结论:MiR-486可以通过影响Sirt1调节TF-1细胞的糖代谢。

人SPRED2基因重组腺病毒载体的制备及其对K562细胞ERK通路的影响

目的:构建携带SPRED2的质粒载体与重组腺病毒载体,并观察其在K562细胞的表达及对ERK信号通路的作用,为Spred2在造血细胞中的作用的研究奠定基础。方法:以HepG2细胞cDNA为模板,RT-PCR克隆SPRED2全长CDS序列,并亚克隆到pCDNA3.0和pshuttle-CMV质粒载体,构建携带SPRED2的真核表达载体pCDNA3.0-Spred2与穿梭载体pshuttle-CMV-Spred2;将线性化pshuttle-CMV-Spred2与腺病毒骨架质粒Adf11p在感受态细胞BJ5183中进行同源重组,产生重组质粒Adf11p-Spred2;后者经线性化后转染至HEK293细胞进行病毒包装;在HEK293细胞扩增病毒颗粒,以CsCl密度梯度离心法进行纯化,TCID50法测定病毒滴度;将病毒颗粒以100MOI感染K562细胞,Western blot检测Spred2过表达情况及Spred2对细胞ERK的影响。结果:经酶切、DNA测序、Western blot检测等方法鉴定,证明pCDNA3.0-Spred2与Adf11p-Spred2携带Spred2序列正确,能够在HEK293细胞、K562细胞正确表达,Spred2过表达能够显著抑制K562细胞ERK活性。结论:成功构建对K562细胞有高感染效率的SPRED2重组腺病毒载体,且Spred2对K562细胞ERK信号通路有显著抑制作用。