α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的亚克隆及DNA链断裂修复研究

目的 :建立α 粒子诱发人支气管上皮细胞 (BEP2D)恶性转化细胞的克隆细胞系 ,研究其核型和DNA链断裂修复能力。方法 :1.5Gyα 粒子照射的BEP2D细胞传 35代后接种裸鼠成瘤 ,取出瘤细胞进行亚克隆 ,挑出单个克隆扩大培养 ,G带显示分析细胞核型 ,脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂。结果 :亚克隆了 5个恶性转化细胞系 (RP35T 1, 2 , 4 , 5 , 6 ) ,核型基本与BEP2D细胞相近 ,但有着不同的染色体缺失 ,其中 2株细胞 (RP35T 2和RP35T 4 )多倍体高达 40 %,明显高于BEP2D细胞。恶性转化细胞RP35T 1和RP35T 4的DNA双链断裂重接修复缺陷。结论 :建立了α 粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的克隆细胞系 ,DNA链断裂修复缺陷可能是α 粒子致癌的一个重要特点。

DNA-PKcs反义核酸增强HeLa细胞对辐射及化疗药物顺铂的敏感性

目的构建表达DNA-PKcs反义核酸的真核表达载体,建立DNA-PKcs表达被反义核酸抑制的细胞模型。方法采用RT-PCR扩增DNA-PKcs的cDNA片段,DNA重组技术构建四环素控制表达的真核表达载体;利用Lipofectamine介导基因转染,Westernblot分析鉴定反义核酸抑制DNA-PKcs表达的细胞模型;细胞克隆形成法和细胞生长曲线分析细胞对UV和顺铂的敏感性。结果克隆了DNA-PKcs5'端320bpcDNA片段,重组于tet启动子控制表达质粒pCIneo-Tet-splice,转染Hela细胞,获得3个稳定转化克隆;Westernblot结果表明细胞中DNA-PKcs表达受到反义核酸的抑制,并且细胞对紫外线辐射和顺铂敏感性增加。结论成功建立了DNA-PKcs表达受到反义核酸抑制的细胞模型,抑制DNA-PKcs表达提高了细胞的辐射和顺铂的敏感性。

α粒子诱发转化人支气管上皮细胞系BEP2D中XRCC5等基因的突变检测

目的与方法 :用聚合酶链式反应 单链构象多态性分析 (PCR SSCP)方法观察α粒子诱发人支气管上皮细胞系BEP2D细胞转化过程中相关基因的改变。结果 :细胞转化过程中 ,双链断裂修复基因XRCC5发生碱基突变 ,改变从转化早期过程就持续存在 ;而p16基因exon2和hMSH2基因exon12未见变化。结论 :XRCC5基因在α粒子照射后早期发生突变 ,使细胞丧失修复双链断裂损伤的能力 ,是α粒子诱发支气管上皮细胞转化过程中的启动事件之一。

DNA依赖蛋白激酶在人支气管上皮细胞癌变株和肺癌组织中的异常表达

目的:探讨辐射诱发人支气管上皮细胞癌变株和肺癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA dependent protein kinase, DNA-PK)的激酶活性或表达变化。方法:用Western blot和p53蛋白为特异性底物的磷酸化反应分别检测癌变细胞中DNA-PKcs表达和激酶活性,用免疫组化结合病理图像定量分析技术检测肺癌组织和癌旁组织中DNA-PKcs蛋白的表达情况。结果:a粒子辐射诱发的人支气管上皮细胞癌变株BERP35T-1的DNA-PKcs表达水平比亲本细胞BEP2D提高30%,激酶活性显著提高。所检测的14例非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs蛋白表达水平普遍高于相对应的癌旁组织,两组之间有显著性差异(P < 0.05)。结论:非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs表达增加,可能成为肺癌的一个生物标记物。

辐射诱发支气管癌变细胞中p14^(ARF)、p16^(INK4a)及BUB3基因甲基化分析

背景与目的肿瘤抑制基因的甲基化是发生肿瘤的重要机理之一,本研究通过检测p14ARF、p16INK4a及BUB3基因在辐射诱发的人支气管上皮细胞癌变株中的甲基化情况,探讨辐射诱发癌变的机理。方法用甲基特异性的PCR(MSP)分析基因启动子区CpG岛的甲基化情况,用RT-PCR检测细胞的基因转录水平及DNA纯化、转化、测序。结果p14ARF基因在正常细胞中没有甲基化,但在其辐射诱发的癌变细胞中发生了甲基化。RT-PCR结果进一步显示p14ARF基因的转录水平显著下降。与p14ARF基因共用2个外显子的p16INK4a基因则没有发生甲基化;BUB3基因在正常细胞及辐射诱发的癌变细胞中均没发生甲基化,并经测序证实。结论在辐射诱发的人支气管上皮细胞恶性转化中,共用两个外显子、与细胞周期调节有关的两个基因p14ARF与p16INK4a的甲基化不同步,甲基化的p14ARF基因出现转录抑制,而与有丝分裂检测点相关的BUB3基因没有发生甲基化。

α粒子诱发BEP2D细胞癌变株中多种基因启动子的异常甲基化

目的 :研究α 粒子诱发人支气管上皮细胞癌变株中 p14 ARF,p16 INK4a,MGMT ,GSTP1,BUB3和DAPK基因的甲基化情况。方法 :用甲基特异性的PCR(MSP)分析基因启动子区CpG岛的甲基化情况和用RT PCR检测细胞的基因转录水平。结果 :p14 ARF基因在BEP2D细胞中没有甲基化 ,但在其癌变细胞BERP35T1中发生了甲基化 ,且甲基化导致 p14 ARF基因的转录水平显著下降。p16 INK4a和BUB3在两种细胞中均没有发生甲基化 ,BUB3经测序证实 ;MGMT在BEP2D细胞和癌变细胞中均发生甲基化 ;DAPK在BEP2D细胞中已有部分甲基化 ,在BERP35T1细胞中完全甲基化 ;GSTP1在BEP2D细胞中没有甲基化 ,在BERP35T1细胞中发生部分甲基化。结论 :在辐射诱发人支气管上皮细胞恶性转化中 ,部分与细胞增殖。

α-粒子诱发BEP2D细胞恶性转化中DNA修复基因DNA-PK的表达和突变分析

目的 :研究α 粒子诱发人支气管上皮细胞 (BEP2D)恶性转化中DNA修复基因DNA PK的结构和表达变化。方法 :用Northernblot杂交检测基因转录水平 ,聚合酶链式反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)分析基因编码序列结构变化。结果 :癌变细胞中DNA修复基因Ku70 (XRCC 6 )的编码碱基发生突变 ,第 114 8～ 115 3位点由AGGATC突变为GAGTAC ,致使编码的氨基酸由RI变为EY ;细胞恶性转化过程中 ,DNA修复基因DNA PKcs(XRCC 7)的表达发生改变 ,在恶性转化早期即α 粒子照射后第 2 1代就已被抑制 ,但发生癌变 (第 35代 )后 ,部分细胞克隆的该基因表达又重新上调。结论 :DNA修复基因DNA PK的结构和表达的变化 ,导致细胞DNA修复能力缺陷 ,基因组不稳定性增加 ,是α 粒子癌变的分子机制之一。

肝胆肿瘤组织中DNA依赖蛋白激酶的表达及意义

目的 通过检测不同类型肝胆肿瘤组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA dependent protein kjnase,DNA—PK)及调节亚基Ku70的表达水平,探讨其与肿瘤恶性程度和侵袭性的关系。 方法 用免疫组化法检测47例肝胆肿瘤组织和部分癌旁组织中催化亚基DNA—PKcs和Ku70蛋白的表达情况。 结果 Ku70广泛表达于所检测的肿瘤组织中,其中腺癌和部分腺瘤表达量最高,但在不同恶性程度和侵袭性的肿瘤组织中的表达差异无显著性。而DNA-PKcs表达在不同类型肿瘤间存在明显差异,肝细胞癌阳性表达率为92.1％,显著高于胆管腺癌(65.3％)和胆曩腺癌(51.9％)(x2值分别为8.95、12.42,P值分别为0.016和0.013),乳头状腺瘤或胆管腺瘤不表达或弱表达。侵袭性腺瘤(癌)组织表达水平为61.2％,显著高于非侵袭性腺瘤(癌)(30.4％)(x2=16.23,P=0.004)。癌旁组织相对低表达DNA-PKcs。 结论 DNA—PKcs表达水平与肿瘤类型、恶性程度、转移或侵袭性有关,有可能成为肝胆肿瘤的一个新的生物标记物。