新城疫病毒致Hep-2肿瘤细胞死亡方式的研究

目的研究新城疫病毒弱毒株致Hep-2肿瘤细胞死亡方式及其作用机制。方法应用AO/EB染色、电子显微镜观察、DCFA染色测定细胞内活性氧水平及罗丹明123染色法测定细胞线粒体膜电位等方法分析新城疫病毒弱毒株致Hep-2肿瘤细胞的死亡方式及途径。结果新城疫病毒弱毒株感染能够导致Hep-2肿瘤细胞浓缩,被AO/EB浓染,细胞核缩小,染色质边集。FACS细胞周期分析显示,感染后的Hep-2肿瘤细胞72 h出现二倍体亚峰,G1期细胞凋亡率为8.59%,电子显微镜观察显示,肿瘤细胞核染色质边集、浓缩,细胞核呈固缩状,呈现典型的凋亡形态。另外,细胞内活性氧水平上升,线粒体膜电位下降。结论新城疫病毒弱毒株主要通过细胞内线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥其抑瘤作用。

减毒水泡性口炎病毒诱导宫颈癌HeLa细胞的凋亡及其作用机制

目的:研究减毒水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)对宫颈癌HeLa细胞的凋亡诱导作用,并探讨其可能的机制。方法:将减毒VSV以1.0 MOI的接种密度感染HeLa细胞,在6、12、18、24和30 h后收集细胞,MTT法检测HeLa细胞的增殖;AO/EB染色观察HeLa细胞凋亡形态学变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测HeLa细胞早期凋亡率,流式细胞术分析HeLa细胞sub-G1凋亡峰,JC-1染色法测定细胞线粒体跨膜电位水平,caspase试剂盒检测HeLa细胞caspase-3、caspase-8及caspase-9的活性。结果:减毒VSV感染HeLa细胞12和24 h后,HeLa细胞增殖活力分别为(78.4±1.9)%和(63.1±5.6)%(P<0.01);早期凋亡细胞率分别为(16.88±2.48)%和(31.9±4.24)%(P<0.01),sub-G1凋亡峰分别为(14.85±1.48)%和(21.05±2.28)%(P<0.01)。随着减毒VSV感染时间的增加,HeLa细胞线粒体跨膜电位逐渐降低(P<0.05),caspase-9和caspase-3的活性显著升高(均P<0.05)。结论:减毒VSV能够抑制HeLa细胞的增殖,并通过caspase-9和caspase-3依赖的途径诱导HeLa细胞凋亡。

马动脉炎病毒N蛋白基因GST融合表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法扩增出马动脉炎病毒核衣壳蛋白基因ORF7,并将其克隆到pMD18-T载体,构建成重组质粒pMD18-N,在上海生物工程公司测序。结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与EAV NC-002532株的同源性为99%。表明ORF7是EAV基因组内的保守序列,将ORF7亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组质粒pGEX-6P-N,用pGEX-6P-N转化表达菌株BL21(DE3),诱导表达后SDS-PAGE和Western blotting分析表明,克隆在谷胱苷肽硫转移酶(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子质量约为40 ku,为马动脉炎病毒病血清学诊断方法的建立奠定了基础。