新城疫病毒HN基因诱导人肺癌细胞SPC-A1凋亡的作用机制

为了探索新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(HN)基因对人肺癌细胞SPC-A1的作用及机制,将含有HN基因的重组质粒pVHN经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,通过MTT方法检测细胞活力;采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色分析肿瘤细胞凋亡;罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位(ΔΨm)和活性氧水平变化;流式细胞仪分析MHC-Ⅰ分子表达;底物染色反应检测caspase-3活性.结果重组质粒pVHN转染人肺癌细胞SPC-A148h后,细胞活力明显降低;AO/EB染色可见明显的细胞凋亡形态学变化;与空质粒对照相比,线粒体ΔΨm下降(P<0·01),活性氧水平升高(P<0·05);细胞表面MHC-Ⅰ分子表达上调(P>0·05);caspase-3活性增强(P<0·01).以上结果提示,新城疫病毒HN基因能够上调SPC-A1细胞表面MHC-Ⅰ分子表达,并通过上调ROS水平,下调线粒体ΔΨm,进而激活caspase-3,最终诱导人肺癌细胞凋亡.

鸡贫血病毒VP3基因与人IL-18基因的共表达对人肝癌细胞BEL-7402的作用

目的利用凋亡素和IL18基因的抗肿瘤优势,设计构建共表达凋亡素和hIL-18基因的真核重组子,检测其在体外对人肝癌细胞BEL7402的作用效果,旨在探索新的肿瘤基因治疗方法。方法将凋亡素VP3基因与hIL-18基因一同克隆到真核表达载体pVAX1上,构建重组质粒pVVP3IL-18,经脂质体介导,转染人肝癌细胞BEL7402,AO/EB染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪分别分析凋亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化,透射电镜分析凋亡细胞超微结构变化。结果随着转染时间的延长,重组质粒pVVP3IL18所表达的目的蛋白对BEL7402细胞的杀伤作用逐渐增强,作用48h,形态学观察表明BEL7402细胞发生明显的凋亡,凋亡率可达(56.5±11.9)%,并且大部分细胞为TUNEL阳性着色,流式细胞术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰,透射电镜观察可见细胞核固缩、染色质聚集等典型的凋亡超微结构变化。结论联合应用凋亡素与hIL18基因,在体外对人肝癌细胞BEL7402具有明显的凋亡诱导作用。

含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组腺病素的构建及鉴定

目的：构建表达新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶（Hemagglutinin—neuramidinase，FIN）基因的重组腺病毒，为进一步研究HN基因对消化道肿瘤的抑制作用及分子机制建立基础。方法：用BamHI和XbaⅠ双酶切质粒pVHN，将获得的HN基因片段连接入穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA，构建含HN基因的穿梭质粒pacAd5-HN。利用PacI单酶切对pacAd5-HN和腺病毒基因组质粒（pAd5）进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞，分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Western blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定，并测定所获得重组病毒的滴度。结果：所构建重组病毒可有效表达HN基因，表达产物分子量约为63kD，重组病毒滴度为10^8～10610PFU／ml。结论：成功构建含HN基因的重组腺病毒，所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求。

新城疫病毒HN基因重组体对人胃癌细胞BGC-823凋亡作用机制研究

目的本实验研究旨在探讨含新城疫病毒HN基因的重组质粒对人胃癌细胞BGC-823凋亡的联合作用机制。方法将含有HN基因的重组质粒pIRVP3IL-18HN经脂质体介导转染人胃癌细胞BGC-823,通过MTT方法检测细胞活力;电镜下观察细胞形态;罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位(△Ψ)和活性氧(ROS)水平变化;底物染色反应检测Caspase-3活性。结果重组质粒pIRVP3IL-18HN转染人胃癌细胞BGC-823后,MTT法结果显示致肿瘤细胞死亡率升高,细胞活力下降;电镜观察肿瘤细胞呈现明显凋亡状态;与阴性空白质粒对照显示,线粒体△Ψ下降,ROS水平升高;Caspase-3活性被激活。结论含新城疫病毒HN基因的重组质粒可以诱导人胃癌细胞BGC-823进入特定的凋亡程序,从而导致人胃癌细胞BGC-823的凋亡。

转染IL-18基因慢性粒细胞白血病树突状细胞的抗白血病作用

目的:探讨转染IL-18基因慢性粒细胞白血病(CML)树突状细胞(DCs)的抗白血病免疫作用。方法:以脂质体介导法将pVAX1-IL-18真核表达质粒转染CML DCs,检测转染IL-18 DCs的IL-18表达,通过流式细胞仪检测转染IL-18 DCs的CD80+、CD86+细胞百分率,并检测IL-18基因修饰DCs刺激T细胞增殖能力、特异性CTL杀伤作用及诱导的NK细胞的杀伤活性。结果:转染IL-18 DCs上清中IL-18的含量为(596±34.1)pg/2×106cells/48 h,而在转染空质粒DCs和DCs上清中未检测到IL-18,且转染IL-18 DCs的CD80+、CD86+细胞百分率高于转染空质粒的DCs(P<0.05)。转染IL-18的DCs刺激T细胞增殖能力、特异性CTL杀伤作用及诱导的NK细胞的杀伤活性明显高于转染空质粒的DCs(P<0.05),且随着S/R或R/T增加,其多种免疫反应逐渐增强。结论:IL-18与DCs抗肿瘤作用具有协同性。

鸡贫血病毒VP3基因诱导人肺癌细胞SPC-A1凋亡的作用机制

探索了重组质粒pVVP3对人肺癌细胞SPC-A1的作用及机制.将pVVP3经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,通过MTT方法检测了细胞活力;采用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色分析了肿瘤细胞凋亡;采用罗丹明123和DCFA染色测定了线粒体跨膜电位（△Ψm）和活性氧水平变化;通过底物染色反应检测了Caspase-3活性.检测分析结果表明：重组质粒pVVP3转染人肺癌细胞SPC-A1后,细胞活力明显降低; AO/EB染色可见明显的细胞凋亡形态学变化;与空质粒对照相比,线粒体△Ψm下降（P＜0.01）,活性氧水平升高（P＜0.05）,Caspase-3活性增强（P＜0.01）.以上结果提示,重组质粒pVVP3能够通过上调ROS水平,下调线粒体△Ψm,进而激活Caspase-3,最终诱导人肺癌细胞凋亡.

戊型肝炎流行病学研究进展

戊型肝炎(hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)引起的病毒性肝炎,主要经粪-口途径传播,多呈散发性流行,也可引起暴发性流行.随着对HEV动物宿主研究的开展,已在多种动物中检测到抗HEV抗体或病毒RNA,同时也发现多起因生食或半生食肉制品发生人员感染的病例,已经证实HE是一种新出现的人兽共患病毒病[1-2].在散发病例中,HE占急性肝炎总数的10%～20%.HEV主要侵害青壮年,常表现为暴发型肝炎,孕妇感染后病死率可达到20%.……

抗肿瘤重组鸡痘病毒体外抑制骨肉瘤细胞S180的效应

目的探讨Apoptin、HN和IL18融合基因的重组鸡痘病毒(vFV3)对骨肉瘤细胞S180的抑制效应。方法以vFV3感染人骨肉瘤细胞S180,应用MTT法检测细胞活性,流式细胞仪分析vFV3感染致S180细胞周期变化,并用Rhodamine123染色结合FCM检测线粒体跨膜电位,从细胞生物学角度探讨vFV3致S180肿瘤细胞凋亡的途径。结果vFV3感染可有效抑制S180肿瘤细胞,杀伤率达46.8%。感染使S180肿瘤细胞线粒体膜电位下降,导致S180肿瘤细胞凋亡。结论vFV3可诱导S180肿瘤细胞凋亡,并主要通过线粒体途径诱导凋亡。

埃博拉出血热

埃博拉出血热(Ebola haemorrhagic fever,EBHF)是一种病死率很高的出血热,病原属丝状病毒,与同科的马尔堡病毒同属高致病性的甲类病毒,但免疫原性不同.EBHF在中非热带雨林地区和东南非洲热带大草原已流行了几个世纪,但一直未引起注意,1976年EBHF在非洲苏丹和扎伊尔相继暴发流行,引起了广泛重视,该病毒以扎伊尔的埃博拉河命名为埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV),是人类所知最为恐怖、致命病毒之一,同艾滋病病毒相比,它潜伏期短、病死快、病死率高[1-3].……

编码SARS-CoV S1和S2蛋白的DNA疫苗对小鼠的免疫应答

目的构建编码SARS-CoVS蛋白亚单位S1和S2的核酸疫苗,并检测其对小鼠的免疫应答。方法依据GenBank中SARS-CoV基因组序列,人工合成SARS-CoVS1和S2亚单位基因,分别与CTL表位基因重组后,克隆至表达载体pIRES1neo中,构建DNA疫苗pIRCTL-S1和pIRCTL-S2。将构建的DNA疫苗转染BHK-21细胞,采用间接免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达。免疫小鼠后,用流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类数,用ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清中抗SARS-CoV抗体水平。结果所构建的DNA疫苗pIRCTL-S1和pIRCTL-S2转染BHK-21细胞后,均能表达抗原蛋白,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,并诱导产生抗SARS-CoV特异性抗体。结论所构建的两种DNA疫苗在小鼠体内均产生了体液和细胞免疫应答,为SARS核酸疫苗的研制奠定了基础。

霍乱毒素黏膜免疫佐剂作用研究进展

霍乱(cholera)是由霍乱弧菌(vibrio cholerae)引起的急性传染病,属三大国际检疫传染病之一,也是我国法定管理的甲类传染病.其病理变化主要由霍乱弧菌的肠毒素所致,临床表现为不同程度的腹泻、呕吐、失水,少数患者出现肌肉痉挛、代谢性酸中毒、循环衰竭等.……

Prion蛋白研究进展

蛋白粒子病是由新型蛋白感染因子引起的人和动物的神经退行性疾病,又称传染性海绵状脑病( transmissible spongiform encephalopathies,TSEs ) .……

实时荧光定量PCR方法检测人癌组织中RFP蛋白的表达

目的检测RFP(Ret finger protein)蛋白在人正常组织及人癌组织中的分布。方法采用实时荧光定量PCR方法,以18 S rRNA为内对照,检测RFP在人正常组织及人癌组织中的表达水平。结果RFP表达水平子宫颈鳞状细胞癌组织高于正常子宫颈组织,子宫内膜腺癌组织高于正常子宫内膜组织,胃腺癌组织高于正常胃组织,食管鳞状细胞癌组织高于正常食管组织,而子宫内膜腺癌组织高于子宫颈鳞状细胞癌组织,胃腺癌组织高于食管鳞状细胞癌组织,脑癌组织高于正常脑组织。结论RFP可能成为治疗恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。

口蹄疫病毒致病分子机制

在病毒感染引起机体发病的过程中,既有病毒与细胞间的相互作用,又有病毒侵入细胞后的一系列反应,包括病毒与细胞间吸附、病毒粒子释放、病毒核酸在细胞内复制等过程.从理论上讲,口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)的任何一种结构蛋白和非结构蛋白、病毒BNA元件、参与病毒复制过程的宿主细胞蛋白和内膜(包括FMDV细胞受体)都可以被认为是毒力因子.这些因子缺陷或者缺乏,将可能引起病毒致病力的变化.……

痘病毒免疫调节策略

面对宿主各种非特异性和特异性免疫,病毒成功侵入宿主并产生感染性后代,须具有逃避、阻塞,甚至破坏宿主抗病毒免疫反应的能力.痘病毒凭借其庞大基因组编码的多种免疫调节蛋白,具有多种复杂、精妙的免疫调控策略[1],成为近年来痘病毒研究的重点和热点.……

表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因重组鸡痘病毒的构建与鉴定

目的构建表达猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组鸡痘病毒。方法将PCV2ORF2基因插入到转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTA-ORF2,将该质粒与鸡痘病毒野生株282-E4共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。经BrdU加压筛选重组鸡痘病毒,采用RT-PCR和间接免疫荧光法进行鉴定。结果重组鸡痘病毒感染的CEF经RT-PCR可扩增出260bp的目的基因,间接免疫荧光检测可见特异性黄绿色荧光,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达。结论已成功构建了1株表达PCV2ORF2基因的重组鸡痘病毒。