人骨髓间充质干细胞体外扩增和向神经细胞定向诱导分化的研究

骨髓间充质干细胞（MSC）是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，在体外不仅可以分化为间充质类细胞，而且可以分化为非间充质类细胞。研究了人骨髓间充质干细胞的体外分离、扩增和向神经细胞的定向诱导分化条件。从骨髓中分离MSC，用MesenCult培养基进行纯化和扩增培养。每扩增一代，细胞数量增加约2－3倍，在体外扩增12代后扩增约4.6×10^4倍；诱导不同扩增代数的MSC向神经细胞分化，诱导后的细胞平均有80％以上呈现典型的神经元样表型。免疫组化法检测发现，神经元样细胞强表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶，组织化学法检测观察到神经元特有结构尼氏体，表明MSC在体外具有向神经细胞分化的潜能。

成人骨髓间充质干细胞体外扩增和定向诱导分化为骨和软骨细胞的研究

体外扩增和定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSC)向骨细胞和软骨细胞分化,从正常成人骨髓中分离MSC,经纯化和扩增后分别用地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C诱导MSC向成骨细胞分化;用无血清培养基和转化生长因子-β诱导MSC向软骨细胞分化;诱导期间用光镜检测分化情况,并通过细胞化学和免疫组化方法检测钙沉积、碱性磷酸酶、软骨细胞分泌的酸性蛋白聚精以及Ⅰ和Ⅱ型胶原表达情况。5.5×10~5个成人骨髓MSC在体外扩增15代后可获得7.5×10^(12)个细胞,扩增约1.36×10~7倍;在地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C诱导培养的第7天,光镜下可观察到少数细胞逐渐由校形变成多角形,碱性磷酸酶呈阳性,于培养的第21天可观察到钙沉积,Ⅰ型胶原呈阳性反应,成人MSC在无血清培养基中和TGF-β诱导下可向软骨细胞分化,阿茜蓝染色可观察到蓝染的酸性蛋白聚糖,Ⅱ型胶原呈阳性反应,因此,成人骨髓MSC在体外可定向诱导分化为骨细胞和软骨细胞。

大鼠骨髓间充质干细胞视网膜下移植观察

目的 鉴定骨髓间充质干细胞 ( mesenchymal stem cells,MSCs)在体外不诱导的条件下视网膜下移植后的定位。方法 体外培养雄性大鼠 MSCs,直接作为细胞供体视网膜下移植于成年雌性大鼠视网膜下 ,4周后将动物处死 ,取眼球做石蜡切片 ,用 Y染色体鉴定 ;为做进一步验证 ,将 MSCs用重组腺相关病毒 AAV- gfp感染后移植 ,分别于 4、8周取动物眼球作冰冻切片 ,于荧光显微镜下做绿色荧光蛋白 ( green fluorescence protein,GFP)表达观察。结果 培养的 MSCs集落生长迅速 ,均一性好 ;Y染色体原位杂交鉴定表明来源于 MSCs的阳性细胞融合入了原来的视网膜结构 ,在光学显微镜下可分布于视锥、视杆细胞层、双极细胞层及节细胞层 ;在荧光显微镜下可见 GFP标记的阳性细胞存在 ,分布于视网膜色素上皮层、视锥、视杆细胞层、双极细胞层及节细胞层 ,细胞形态与结构同周围的视网膜相似 ;2种标记方法检测到的视网膜结构完整 ,未见到玫瑰花结样结构。结论 MSCs可在视网膜下移植后 4周与原视网膜结构相融合 ,2种方法检测到的阳性细胞分布于视网膜色素上皮层、视细胞层、双极细胞层及节细胞层。

人脂肪间充质干细胞生物学特征及体外向类角质细胞的分化

目的:在体外不同培养条件下,脂肪来源间充质干细胞可以向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、内皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞和肝脏细胞等不同胚层来源的细胞分化。观察脂肪间充质干细胞在体外培养并向类角质细胞分化的能力。方法:实验于2005-06/2006-03在解放军军事医学科学院完成。实验方法:取20～45岁健康女性(已取得患者同意)脂肪组织行脂肪抽吸术后的脂肪颗粒。参照Zuk等方法分离脂肪间充质干细胞。取培养的第3代细胞,采用流式细胞仪鉴定细胞表面分子及细胞周期。取状态良好、融合至瓶底80%的第20代细胞,在5mg/L的秋水仙素处理后采集分裂细胞,以Giemsa染色进行核型分析。取第3代细胞以5μm维甲酸和5μg/L表皮细胞生长因子培养基向角质细胞诱导分化。对照组用含体积分数为0.05胎牛血清的L-DNMEM培养基。实验评估:采用倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学方法检测角质细胞的标志物CK19。结果:①脂肪来源间充质干细胞表面分子CD29、CD90、CD44呈阳性,而CD34呈阴性。②细胞增殖曲线呈S型,接种的前3d细胞处于滞留期,3d后进入对数生长期,6d后进入平台期,细胞的群体倍增时间约为29h。处于对数生长期的细胞80%以上处于G0和G1期。③细胞染色体核型分析显示,染色体数目2n=46,核型46,xx,为女性正常核型。④对照组细胞贴壁后,呈成纤维细胞样,细胞呈长梭形,排列成漩涡状,贴壁较好。诱导组从诱导的第3天开始,细胞逐渐变成不规则,诱导第10天出现铺路石改变,形似角质细胞。⑤免疫组织化学方法检测显示,部分细胞专一地对CK19抗体呈阳性反应,有棕色染色。结论:可从人脂肪抽吸物中分离出间充质干细胞,脂肪间充质干细胞在体外一定条件下可向类角质细胞分化。

ABCG2/Bcrp1转运蛋白:侧群干细胞的表型标记与功能调控蛋白

在骨髓、骨骼肌及神经组织均发现侧群干细胞 (SPSCs)。ABC转运蛋白ABCG2 /Bcrp1基因在不同来源侧群 (SP)干细胞均呈高表达 ,且该基因表达与SP细胞表型密切相关。SP细胞能向不同类型或不同胚层的组织细胞分化 ,很可能代表了一群更原始的干细胞 ,且与干细胞可塑性相关。而ABCG2 /Bcrp1在造血及神经等组织来源的SP干细胞中的特异表达 ,使得该转运蛋白成为从不同组织中分选多潜能干细胞的一种新的表型标记。

基因表达连续分析技术及应用研究的进展

随着功能基因组学研究的兴起 ,基因表达连续分析技术 (SAGE)已成为高通量研究基因表达谱的新手段。 SAGE技术不仅可以用来研究大部分基因组序列尚未鉴定的生物个体的基因表达谱 ,其实验结果还可以直接与发表在 SAGEmap表达数据库中不同来源的已知文库相比较 ,应用日益受到重视。