经静脉途径移植骨髓间充质干细胞修复梗死心肌的可行性与安全性研究

目的探讨经静脉注射移植同种异体骨髓来源间充质干细胞(MSC)修复损伤心肌是否可行和安全,观察移植MSC在宿主的归巢与组织学分布。方法雄性Wistar大鼠30只,分为正常大鼠MSC移植组,急性心肌梗死MSC移植组,假手术组,每组10只。结扎冠状动脉左前降支,建立大鼠急性心肌梗死模型。体外分离纯化、扩增同种大鼠骨髓MSC,于建立心肌梗死模型24h给各组大鼠经静脉输注4’6’二乙酰基2苯基吲哚(DAPI)标记的MSC,4周后处死、摘取心脏等脏器,行组织病理切片和免疫组织化学染色。结果(1)在急性心肌梗死MSC移植组,梗死区及其周边部位可见到DAPI标记的MSC;(2)在梗死心肌周边区,移植的MSC胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白I和转录因子4免疫组织化学染色阳性;(3)在各组大鼠其他脏器,移植的MSC主要分布在肺脏、脾脏和肝脏;(4)细胞移植大鼠心肌组织切片未见淋巴细胞增殖,各脏器没有肿瘤形成。结论经静脉移植的MSC可归巢至大鼠梗死心肌部位,并分化为心肌细胞表型,该方法治疗缺血性心脏病安全、可行。

移植时机对骨髓间充质干细胞修复梗死心肌的影响

目的 :观察心肌梗死后不同炎症微环境对骨髓间充质干细胞 (MSCs)移植后在大鼠梗死心肌中的定位、存活及分化情况 ,探讨细胞治疗的最佳时间窗 .方法 :建立大鼠左冠状动脉结扎的心肌梗死模型 ,心肌梗死后 1h及 1,2 ,4 ,8wk分别取心脏进行组织学观察 ;将经过 4’ ,6 二脒 2 苯基吲哚 (4’ ,6 diamidino 2 phenylindole ,DAPI)标记的同种骨髓间充质干细胞在心肌梗死后 1h及 1,2 ,4 ,8wk移植到心肌梗死边缘区(每组n =10 ) ,对照组心肌梗死后 1h注射等量培养基 (n =10 ) .心肌梗死后不同时间点采集心脏标本进行HE染色观察炎症反应的变化 ,细胞移植治疗各组在心肌梗死后 8wk测定心脏功能、心脏瘢痕面积以及免疫组化染色鉴定细胞分化情况 .结果 :分离纯化的大鼠MSCs经流式细胞术鉴定为CD4 4 +CD90 + /CD34-CD4 5 -CD31-,心肌梗死后 1wk梗死相关区的炎症反应较强 ,2wk时减弱 ,4～ 8wk时瘢痕完全形成并出现左室重塑 .1wk移植组未发现有移植细胞存活 ,左室心功能及瘢痕面积百分比与对照组相似 ,1h及 2 ,4wk细胞移植组心肌组织冰冻切片中可观察到大量标记细胞存在 ,并向周围迁移分布 ,免疫组化显示阳性标记细胞desmin,ctnI阳性 ,左室血流动力学指标及瘢痕面积百分比与对照组比较均有改善(P <0 .0 5 ) ,2wk的左?

骨髓间充质干细胞的体外趋化与单核细胞趋化蛋白1的作用

目的:观察单核细胞趋化蛋白1对骨髓间充质干细胞体外增殖和迁移的作用,及单核细胞趋化蛋白1抗体对该作用的影响。方法:实验于2003-12/2004-02在军事医学科学院野战输血研究所干细胞生物实验室完成。取10只健康雄性Wistar大鼠骨髓,体外分离、培养骨髓间充质干细胞,选择第2代作为实验细胞。观察0,5,25,50,75,150μg/L单核细胞趋化蛋白1对大鼠骨髓间充质干细胞的生物学作用;通过细胞迁移实验,观察0,5,25,50,75,150μg/L单核细胞趋化蛋白1对骨髓间充质干细胞的体外趋化作用,以及加入单核细胞趋化蛋白1抗体中和后其对骨髓间充质干细胞趋化作用的变化;应用反转录多聚酶链反应方法,检测大鼠骨髓间充质干细胞有无单核细胞趋化蛋白1相关受体细胞趋化因子受体2的表达。结果:①二甲基偶氮唑盐法测定细胞增殖实验结果:在体外,单核细胞趋化蛋白1以浓度梯度(0,5,25,50,75,150μg/L)依赖方式促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖,但作用较温和。②细胞迁移实验结果:单核细胞趋化蛋白1以浓度梯度(0,5,25,50,75,150μg/L)依赖方式促进大鼠骨髓骨髓间充质干细胞的定向迁移,该作用显著(P<0.05)。③抗体中和后的迁移实验:75μg/L质量浓度单核细胞趋化蛋白1对骨髓间充质干细胞的促迁移作用可被单核细胞趋化蛋白1中和抗体明显减弱(P<0.05)。④反转录聚合酶链反应方法证实骨髓间充质干细胞表达单核细胞趋化蛋白1的相关受体细胞趋化因子受体2。结论:在体外,单核细胞趋化蛋白1以浓度梯度依赖方式引起骨髓间充质干细胞的定向迁移,而且该作用可被单核细胞趋化蛋白1中和抗体减弱。单核细胞趋化蛋白1可能通过与细胞趋化因子受体2结合后发挥作用。本实验为了将影响因素相对简单化,便于观察其中的相互关系,并非将体外实验结果完全等同于在体情况。

神经干细胞移植对帕金森病模型大鼠的治疗作用

目的观察大鼠神经干细胞(NSC)植入帕金森病(PD)模型大鼠的脑纹状体后的存活、分化及功能状态。方法体外分离培养NSC,单克隆培养,免疫细胞化学检测多向分化潜能和特异性标记nestin。建立PD大鼠模型,纹状体内植入DAPI标记的NSC,检测6-羟基多巴胺(6-HHDA)诱发的旋转行为,荧光检测标记细胞的分布情况,免疫细胞化学和高效液相色谱检测细胞分化和神经递质含量。结果培养的NSC表达nestin,具有自我更新和多向分化能力;NSC植入PD模型大鼠纹状体后大鼠诱导旋转行为显著改善(P<0·05);NSC在脑内迁移,并在纹状体内形成少量酪胺酸羟化酶(TH)阳性细胞、纤维;植入后纹状体内多巴胺(DA)及其代谢产物含量上升,2个月时分别增加3·6倍和2·8倍,4个月时增加3·4倍和2·4倍(P<0·01)。结论神经干细胞在体外大量扩增后植入PD脑内能长期存活并分化、分泌神经递质,从而部分改善PD症状。

HTm4基因在造血细胞周期调控中的作用

为了研究HTm4基因在造血细胞细胞周期调控中的作用,以佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导K562细胞分化为模型,利用流式细胞术(FACS)及半定量RT-PCR对分化过程中细胞周期的变化及HTm4基因的表达进行了分析,并利用.Tet-Off调控表达系统,将HTm4基因以及C端功能域缺失的HTm4-ct转染K562细胞,观察对细胞周期的影响。结果表明,PMA同时引起了K562细胞的增殖和分化,G0/G1期细胞的比例以及HTm4基因的表达均呈现出波浪形的变化趋势,说明HTm4基因可能参与了细胞退出细胞周期的过程。HTm4基因转染后引起K562细胞滞留于G0/G1期,但C端功能域缺失的HTm4-ct没有此作用,说明C端功能域在HTm4基因调控细胞周期的功能中发挥重要作用。

一个用于转染细胞分选的双顺反子载体的构建及其应用

为简化转染细胞的分选过程,构建了一个含有细胞表面标志CD34基因的双顺反子载体p3.1-IRES-CD34.利用来源于脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES),实现目的基因与CD34基因的共同表达.将绿色荧光蛋白(EGFP)作为目的基因插入载体的多克隆位点,然后转染NIH-3T3细胞,通过免疫磁珠分选(MACS)方法来分选细胞.结果表明:对于转染细胞,均可实现快速分选(瞬时转染细胞约48h,稳定转染10￣15天),并且获得较高纯度(95%以上)的表达目的基因细胞.

成体干细胞的可塑性及其在再生医学应用中的思索

近年来, 随着对胚胎干细胞研究的不断深入, 以及在此基础上对成体干细胞生物学特性的逐步认识, 人们发现, 成体干细胞除了具有较强的自我更新和增殖、分化潜能外, 还具有可塑性. 成体干细胞可塑性现象的发现, 使得人们对于今后应用它们进行细胞再生治疗以替代因损伤或疾病导致的组织缺损而充满希望. 尽管成体干细胞可塑性的发生机制及其在再生医学中的应用等问题尚存争议, 对于这些基本问题的深入探索无疑会使成体干细胞在未来的细胞和组织工程中具有广阔的应用前景.

同种异体骨髓间充质干细胞在大鼠心脏的迁移及分化

目的 探讨同种异体骨髓间充质干细胞 (MSC)在大鼠心脏定居存活情况、同种异体移植是否可行。正常心脏微环境与梗死心脏微环境对骨髓间充质干细胞 (MSC)迁移、分化的影响。方法 雌性Wistar大鼠 35只 ,①正常心脏MSC移植组 (1 0只 ) ;②急性心肌梗死对照组 (AMI,1 0只 ) ;③心肌梗死MSC移植组 (1 0只 ) ;④单个核细胞治疗组 (5只 )。结扎左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型。分离纯化来自雄性Wistar大鼠的骨髓MSC ,于冠脉结扎后 1～ 3h植入到雌性正常大鼠和心肌梗死大鼠心脏组织 ,模拟同种异体细胞移植治疗。于细胞移植后 1 0周取心脏检测各种指标。结果(1 )经纯化的大鼠MSC在同种异体大鼠心脏可定居、生存 ,而未经纯化的单个核细胞移植在同种异体大鼠心脏未见存活 ;(2 )在正常心脏微环境中 ,带蓝色荧光的供体MSC细胞核呈小岛屿状分布 ,与宿主心肌纤维排列无关 ;而在心肌梗死模型大鼠心脏微环境中 ,蓝色细胞核分布广泛 ,呈椭圆形 ,似心肌细胞核 ,其排列方向与宿主心肌纤维排列方向一致 ,免疫组化检测胞浆心肌特异蛋白染色阳性。结论 纯化的MSC具有免疫耐受特性 ,无需加用免疫抑制剂 ,可进行同种异体移植 ;同种异体MSC在正常心脏微环境中不发生迁移、分化 ;

同种异体移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠心肌梗死

目的 探讨同种异体骨髓间充质干细胞 (MSCs)在梗死大鼠心脏局部存活、迁移、分化及对心功能的影响 ;明确同种异体细胞移植治疗心肌梗死 (MI)的可行性及效果。方法 雌性Wistar大鼠 3 5只 ,随机分为正常对照组、急性心肌梗死 (AMI)组及MI +MSCs治疗组。分离纯化雄性Wistar大鼠骨髓MSCs ,于左冠状动脉前降支结扎后 1～ 3h植入到雌性大鼠心脏组织 ,移植后 10周检测心功能并取心脏检测各种相关指标。结果 异体大鼠MSCs经纯化后可在梗死心脏组织定居、生存 ,并与宿主心肌纤维排列方向一致 ,免疫组化检测胞质心肌特异蛋白染色阳性 ,与MI组比较 ,异体细胞移植组左室收缩压升高 (P <0 0 5) ,舒张末压明显降低 (P <0 0 1)、左心室内压最大上升和下降速率显著增快 (P <0 0 5) ,梗死边缘区心肌面毛细血管数目明显增加 (P <0 0 5) ,多功能真彩色病理图像分析系统显示MI面积缩小 (P <0 0 5)。结论 同种异体MSCs移植治疗MI可行。

同种异体骨髓间充质干细胞心内膜移植治疗小型猪急性心肌梗死

目的：探讨同种异体骨髓间充质干细胞（MSCs）心内膜移植治疗小型猪急性心肌梗死的疗效。方法：分离、纯化、扩增培养小型猪MSCs;开胸结扎第1与第2对角支间前降支中段形成急性前壁心肌梗死的动物模型,心肌梗死后2-3周经心内膜注射移植DAPI标记的同种异体MSCs,心肌梗死前、后及移植后3个月行超声心动图及生化检查,并取梗死周围心肌组织冰冻切片及苏木精-伊红染色,免疫荧光法鉴定结蛋白（desmin）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的表达。结果：每40ml骨髓液经2-3周传3代平均获得（3.81±0.09）×107个细胞,移植后3个月左室射血分数较心肌梗死后及对照组改善明显,分别为（56.7±0.8）%,（40.1±1.2）%,（34.9±0.9）%（均P〈0.05）,肝肾功能、血糖及血气分析正常,3个月冰冻切片可见坏死心肌周围细胞核蓝染的移植细胞,免疫组化提示desmin及cTnI表达阳性。结论：同种异体MSCs经心内膜移植安全有效,心功能明显改善。

人伴肌动蛋白相关锚定蛋白基因cDNA的克隆与功能分析

小鼠伴肌动蛋白相关锚定蛋白 (N RAP)是已知的与肌纤维生成有关的细胞骨架蛋白 ,但是 ,与此对应的人类N RAP基因的cDNA序列及其功能一直是未知的 .为了明确N RAP基因在人类中所起的作用 ,利用生物信息学分析工具和分子生物学技术 ,成功地克隆了人N RAP基因 .人N RAP基因cDNA序列含有一个 5 0 88bp的开放读码框 ,与小鼠N RAP基因有 86 %的相似性 .染色体定位分析表明 ,人N RAP基因定位于 10 q2 5～q2 6之间 ,编码区由 4 1个外显子组成 ,与HABP2和CASP7紧密连锁 .电子表达谱分析表明 ,肌肉、心脏、脑、脊髓和前列腺有人N RAP基因不同长度的cDNA序列 .人N RAP与小鼠N RAP蛋白质序列有 88%的相似性 ,与人Nebulin有约 6 3%的相似性 ,与小鼠Nebulin有约 5 9%的相似性 .结构域分析发现 ,N端为LIM结构域 ,从第170位氨基酸开始 ,连续出现 4 0个Nebulin相关重复序列 .RT PCR实验表明 ,人N RAP基因在成人脑、骨骼肌和心脏组织中都有表达 ,在骨髓中不表达 .亚细胞定位研究显示 ,人N RAP基因表达于胞浆 .基于序列相似性、结构域分析、表达谱分析和亚细胞定位研究 ,可以推测人N RAP与小鼠N RAP同属Nebulin家族 。

转基因肝星状细胞定向诱导骨髓Thy-1^+β_2M^-细胞向肝细胞分化

体内移植研究表明,骨髓来源的干细胞具有向成熟的肝细胞分化的能力。然而,成体干细胞向肝细胞诱导分化的效率、分化细胞的功能状态、微环境对细胞分析的影响等均存在许多疑问。以高效、稳定表达肝细胞生长因子的肝星状细胞株CFSC/HGF作为饲养细胞,成功地将大鼠骨髓来源的Thy-1+β2M-细胞(bone marrow derived Thy-1+β2M- cells,BDTCs)诱导为肝细胞,经RT-PCR和免疫荧光化学检测证实,该条件下诱导后的BDTCs表达幼稚或成熟肝细胞特异性的基因,分化细胞具有成熟肝细胞特有的靛青绿摄取排泌、氨基代谢和白蛋白分泌的功能,提示肝细胞生长因子、肝脏非实质细胞及其产生的细胞外基质为骨髓干细胞向肝细胞分化提供了适宜的微环境。这为以骨髓干细胞为基础的再生医学在终末期肝病治疗中的应用提供了理论和技术上的支持。

豆类凝集素FRIL通过调控细胞周期分子的表达维持造血干／祖细胞的静息

目的从细胞周期角度探讨豆类凝集素FRIL（Flt3 receptor—interacting lectin）体外维持造血干／祖细胞静息的分子机制。方法以添加FRIL、Flt3配体（FL）和不添加因子的培养基分别培养脐血CD34^＋细胞，采用RT-PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平检测细胞周期相关分子的表达。结果新分离的CD34^＋细胞中未检测到G0／G1期相关Cyclin和CDK蛋白的表达，培养3d时FRIL组CyclinD3、CDK6蛋白相对表达量（分别为483±63、553±39）低于两个对照组（FL组：2437±52、3209±98；空白对照组：914±105、1497±55）；培养3d时FRIL组P27蛋白相对表达量（0．312±0．030）低于对照组（FL组：0．787±0．024；空白对照组：0．616±0．029），但表达较高的P53蛋白（FRIL组、FL组、空白对照组分别为4．476±0．159、0．581±0．099、2．167±0．114）。FRIL组细胞周期正向调节因子的mRNA相对表达量低于或相当于FL组和空白对照组。结论FRIL通过抑制参与造血细胞周期调控的CyclinD3和CDK6的表达，延迟了造血干／祖细胞的细胞周期，P27在FRIL抑制造血干／祖细胞分化中发挥了重要作用，P53也参与了FRIL对造血干／祖细胞的维持作用。