新型α-半乳糖苷酶清除动物红细胞表面αGal抗原的研究

异种抗原αGal是引起异种移植免疫排斥反应的重要原因之一。脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶是一种新型的糖苷酶,能够切除支链多糖和直链多糖末端的αGal残基。本研究探讨新型α半乳糖苷酶清除红细胞表面αGal抗原的作用。利用新型的基因重组α-半乳糖苷酶酶解牛、猪、狗、兔红细胞上的异种抗原,并用流式细胞术分析细胞表面的αGal抗原。结果表明,动物红细胞表面的异种抗原αGal被完全或部分清除。结论:新型α-半乳糖苷酶可以用来清除异种红细胞上的αGal抗原,对降低异种移植引起的超急性排斥反应具有潜在意义。

丙氨酸溶液作为A→O血型转变酶解缓冲液的研究

本研究旨在探讨丙氨酸缓冲液对α-N-乙酰半乳糖胺酶发挥高效酶解A抗原活性的影响。用Western blot检测α-N-乙酰半乳糖胺酶在丙氨酸等不同缓冲液中与红细胞的结合能力。结果表明,丙氨酸溶液也可以作为A→O血型转变的酶解缓冲液,α-N-乙酰半乳糖胺酶在丙氨酸溶液中酶解A型红细胞所用剂量与在甘氨酸溶液中的相当;Western blot证实,在丙氨酸溶液中α-N-乙酰半乳糖胺酶与红细胞结合能力与在甘氨酸中相似,这也进一步证明α-N-乙酰半乳糖胺酶与红细胞的结合是α-N-乙酰半乳糖胺酶发挥酶解A抗原的活性所必需的。结论:丙氨酸溶液可以作为A→O血型转变的酶解缓冲液,在这一缓冲液中α-N-乙酰半乳糖胺酶与红细胞紧密结合,可以发挥高效的酶解A抗原的活性。

荷斯坦奶牛红细胞作为异种血源的研究

α-Gal抗原是引起异种移植超急性排斥反应的主要异种抗原。本研究探讨新型基因重组α-半乳糖苷酶对荷斯坦奶牛红细胞上的异种抗原的作用。用酶解法清除红细胞表面的α-Gal抗原,用盐水法或抗人球蛋白法进行奶牛红细胞与人血浆的凝集试验,用流式细胞术检测奶牛红细胞表面的α-Gal抗原(FITC-IB4)标记和FITC-IgG标记红细胞的荧光强度。结果表明,盐水法和抗人球蛋白法检测显示,酶解后荷斯坦奶牛红细胞与人混合血清不发生凝集。流式细胞术检测显示,酶解后荷斯坦奶牛红细胞较酶解前其FITC-IB4标记率降低了99.0%,FITC-IgG标记率降低了87.8%。结论:新型α-半乳糖苷酶可以用来清除荷斯坦奶牛红细胞上的α-Gal抗原,且荷斯坦奶牛红细胞的异种抗原主要是α-Gal抗原。酶解法制备的荷斯坦奶牛红细胞可能成为人血替代品。

大肠杆菌菌蜕作为核酸疫苗载体的实验方法研究

目的制备大肠杆菌DH5α菌蜕,并用其装载核酸片段以及质粒DNA,体外转染抗原递呈细胞,探讨其作为DNA疫苗载体的可能性。方法将构建有φX174噬菌体裂解蛋白的温控型表达质粒pHH43转化入大肠杆菌DH5α中,诱导细菌裂解制备大肠杆菌DH5α菌蜕,利用制备的DH5α菌蜕装载核酸片段,并摸索出较好的装载方法用于质粒DNA的装载,然后转染巨噬细胞RAW264.7,观察转染效果。结果成功制备了大肠杆菌DH5α菌蜕,细菌的裂解效率可达97.8%,对核酸片段和质粒DNA的装载效率分别达94.89%和91.98%,装载红色荧光蛋白质粒pDSred-N1的DH5α菌蜕转染巨噬细胞RAW264.7,红色荧光蛋白的表达效率可达50%。结论大肠杆菌DH5α菌蜕可以用于装载核酸疫苗并将其靶向性地导入到抗原递呈细胞中,可获得较高的表达效率,初步验证了大肠杆菌DH5α菌蜕作为核酸疫苗载体的可行性。

联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶实现红细胞AB→O血型转变

目的研究酶解去除AB型红细胞表面的A和B抗原、实现AB→O血型转变的方法,以获得通用型红细胞。方法联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶酶解AB型红细胞,用单克隆抗-A、抗-A1和抗-B抗体检测酶解效果,用稀有血型抗体检测酶解前后红细胞表面的稀有血型,用流式细胞术检测酶解前后红细胞表面A、B、H抗原,原子力显微镜观察酶解前后红细胞形态,主侧配血试验检测酶解红细胞是否符合临床输血要求。结果A1B和A2B亚型红细胞的A、A1和B抗原均能够完全被酶解去除,酶解前后红细胞的稀有血型抗原不变;流式细胞术显示,酶解后AB型红细胞表面的A和B抗原消失,而H抗原明显增加,和O型红细胞相当;酶解不影响红细胞的形态;主侧配血试验证明酶解改造后的AB型红细胞可以安全输给O、A、B、AB等各型受血者。结论联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶成功实现了AB→O血型转变,获得酶解通用型红细胞。

α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面的α-Gal抗原

目的:探讨脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面α-Gal抗原的作用。方法:用不同浓度的α-半乳糖苷酶酶解猪红细胞、猪胚肾细胞PK15、猪睾丸细胞ST和原代培养的猪成纤维细胞上的α-Gal抗原,酶解温度为26℃,作用时间为2 h;用25μg/m L的FITC-IB4凝集素标记酶解前后的细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面α-Gal抗原的清除率。结果:流式细胞检测结果表明,不同组织来源的猪细胞表面的α-Gal抗原的表达量明显不同,所需酶的剂量也不同,但其表面的α-Gal抗原均能被α-半乳糖苷酶清除。结论:脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶可以清除猪细胞表面的α-Gal抗原,提示该酶对降低异种移植引起的超急性排斥反应有重要意义。

新型高比活力α-N-乙酰半乳糖胺酶应用于人红细胞A→O血型改造

α-N-乙酰半乳糖胺酶(α-N-acetylgalactosaminidase,αNAGA)是进行人红细胞(reblood cell,RBC)A→O血型改造的工具酶.采用PCR法从国内临床标本的脑膜脓毒性金黄杆菌中克隆出新型αNAGA基因,应用基因工程和蛋白质纯化技术获得足量高纯度的重组酶.重组酶分子量为49.6kD,专一性强,比活力高,在25℃及pH6.8条件下,1h内完全酶解1UA1型浓缩RBC(约100mL/U)需1.5mg酶,而1h内完全酶解1UA2型浓缩RBC仅需0.4mg酶.酶解后的A型RBC与抗A单克隆抗体、人源O型血清反应均不凝集,与A,B,O,AB等各型血清的主侧配血实验成功,主要稀有血型不变.流式细胞仪检测结果表明,酶解后A抗原和A1抗原消失,H抗原增加,证明A→O血型改造成功获得的酶解通用型RBC可以安全输给A,B,O,AB等各型受血者,不会因ABO血型不合发生输血反应.脑膜脓毒性金黄杆菌来源的αNAGA是十分理想的A→O血型改造的工具酶,具有良好的应用前景,对于提高输血安全性、消除血液偏型、节约输血成本、增强应急输血保障能力具有重要意义.