NK细胞免疫球蛋白样受体与异基因造血干细胞移植的研究进展

NK细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIR）是主要表达于人NK细胞表面的受体，在所有人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）I类分子所识别的NK细胞独特型受体中，免疫球蛋白样超家族受体KIR占主导地位。由于它的配体参与多种免疫反应，因此，KIR在机体抗感染免疫、肿瘤免疫和移植免疫中都发挥重要作用。

重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析

研究目的是分子设计并构建较G-CSF单体分子具有半衰期更长、生物活性更高的新型重组人G-CSF/G-CSF双体分子(简称G-G),并在原核系统进行高效表达。分别构建pET32/G-G和pET32/G原核表达载体,实现G-G双体融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白纯化;对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性、抗原性及亲水性进行模拟分析;采用MTT法对G-G双体融合蛋白的生物学活性进行测定。结果首次构建成功了G-G双体分子融合蛋白高效表达载体,表达量高于40％,一步亲和层析所获融合蛋白的纯度为80％左右。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,G-CSF双体分子的等电点、柔性、抗原性及亲水性均未显著改变。活性测定表明,所构建表达的重组人G-G双体分子能有效刺激G-CSF依赖细胞株NFS-60的增殖,但其刺激效应低于G-CSF的单体和标准品。结果表明,所构建表达的G-CSF的单体和G-G双体分子均可在大肠杆菌中获得高效表达,但G-G双体分子的比活性不及G-CSF单体分子,与预期设想的有差别,其原因正在研究之中。

我国汉族人群HLAⅠ类经典基因单倍型及连锁分析

本研究旨在探讨我国汉族人群HLAⅠ类经典基因座位HLA-A、HLA-B、HLA-Cw位点的基因频率,单倍型频率及连锁特征。采用序列特异性引物(SSP)PCR低分辨基因分型技术对1014例随机选择的无关个体的经典HLAⅠ类位点进行基因分型,并对其相关遗传学参数进行统计学分析。结果发现汉族人群中较为常见的HLA-Ⅰ类基因是A*02(0.33)、A*11(0.24)、B*15(0.14)、B*13(0.13)、Cw*03(0.25)、Cw*07(0.18);较为常见的单倍型是A*02-B*46(0.071)、A*11-B*15(0.051)、A*02-Cw*01(0.084)、A*11-Cw*03(0.079)、B*46-Cw*01(0.095)和B*13-Cw*03(0.071)等,其中A*02-B*46、A*30-B*13、A*30-Cw*06、A*02-Cw*01、B*46-Cw*01和B*58-Cw*03等单倍型呈现出显著的连锁不平衡;而A*02-B*15、A*02-B*40、A*24-Cw*03、A*02-Cw*03、A*31-Cw*03等连锁不平衡性相对较低,其中A*24-Cw*03在重组事件中较常出现。此外,A*02-B*46-Cw*01(0.075)、A*30-B*13-Cw*06(0.046)、A*11-B*13-Cw*03(0.045)、A*33-B*58-Cw*03(0.044)、A*11-B*15-Cw*08(0.027)、A*02-B*38-Cw*07(0.023)、A*11-B*40-Cw*07(0.022)等为常见扩展单倍型。结论:本研究较系统地分析了我国汉族人群的HLA遗传学分布特点,为群体进化、临床移植及疾病相关研究等提供了有价值的遗传学资料。

编码人B7-2胞外区cDNA的克隆、表达及生物活性鉴定

B7 2分子是共刺激信号系统B7/CD2 8/CTLA 4中的重要成员之一 ,为了更深入地探讨B7 2分子在调控T细胞增殖、分化及相关信号传导过程中的作用 ,本研究通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增编码人B7 2分子胞外区的cDNA ,测序后定向插入多个原核表达载体并诱导目的蛋白表达 ,用Western印迹和MTT鉴定生物活性。结果表明 :通过pGEX 4T 2载体实现了在宿主菌BL 2 1 (DE3) codenplus RIL中较高水平的表达 ,蛋白表达量为 2 0 %。经Western印迹和MTT鉴定 ,所表达及初步纯化的B7 2胞外区重组蛋白能与抗人B7 2单抗发生特异性结合 ;在抗人CD3单抗的协同下 ,B7 2胞外区重组蛋白能有效地促进外周血单核细胞的增殖。结论 :B7 2胞外区重组蛋白的获得为进一步研究B7

血小板生成素双体分子的融合构建、原核表达及其分子结构特性预测

目的为了研制更稳定、高效、低毒的血小板生成素(TPO),拟设计构建TPO的双体分子(TT)并在原核中表达,同时预测其融合蛋白的分子结构特性。方法采用分子克隆方法分别构建TPO单体分子与双体分子的原核表达载体pET32/TPO和pET32/TT,并在大肠杆菌中进行表达,以Westernblot鉴定表达产物;用生物信息学方法DSGene1.1和ProtScale软件,对该融合蛋白的结构特征如电点、柔性、抗原性及亲水性等进行模拟分析。结果成功构建TPO双体分子pET32/TT的原核表达载体,并经NcoI和NotI双酶切电泳及测序证实。通过转化origamiTM(DE3)感受态菌及IPTG诱导获得高效表达,其产量在40%以上;Westernblot显示表达产物能与抗TPO单克隆抗体特异性结合。对TT双体分子融合蛋白的结构特性预测表明,其融合蛋白中的两个TPO单体分子等电点、抗原性及亲水性均无显著改变,接头处具有高柔性。与TPO的原始序列相比,TT的一级结构中有2个氨基酸发生改变,在接头(L)后插入一段34个氨基酸的新序列(N)。此序列具有一定的抗原性和亲水性,呈现β片层结构。结论本研究所构建表达的TPO单体和TT双体分子均可在大肠杆菌中获高效表达,TT双体分子的结构预测符合设计要求,为进一步研究新型TT双体分子融合蛋白的生物学特性提供了基础。

新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的表达优化及下游纯化

目的优化提高重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白在原核细胞中的表达量,并建立有效的下游纯化路线。方法对IL6D24-PE40KDEL的受体菌、菌体生长状态及诱导表达时间等进行优化,经反复筛选确定了高效简捷的纯化路线:即将Q型强离子交换树脂与DEAE弱离子交换树脂相结合的两步纯化法。结果宿主工程菌HB101的优化表达条件为2%接种量,30℃培养3h,42℃再诱导4h,可使目标蛋白的表达量由最初的13.5%提高到23.8%;经12%SDS-PAGE蛋白电泳证实,特异性表达产物为包涵体形式,占包涵体蛋白的40%,分子量约为60kD,与所预测的IL6D24-PE40KDEL融合蛋白的分子量相吻合。两步纯化法可获得纯度>95%的IL6D24-PE40KDEL融合蛋白,纯化蛋白的回收率为8.7%,经Western-blot实验证明,它可同PEA多抗和IL6单抗特异性的结合。MTT试验检测证实,该融合蛋白能特异性的杀伤高表达IL6R的U266多发性骨髓瘤细胞,ID50为180ng/ml;而对IL6R的T淋巴白血病细胞CEM则无杀伤,ID50>1000ng/ml。结论获得了高表达重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的菌株并建立了高效简捷的下游纯化路线,融合蛋白能特异性的杀伤表达IL6R的多发性骨髓瘤细胞系U266。

造血干细胞移植供受体人群HLA-Cw基因遗传多态性研究

目的调查了人类白细胞抗原(humanleucocyte antigen, HLA)Cw位点在中国汉族人群中的等位基因分布规律,为进一步研究Cw位点的遗传特征提供背景资料。方法采用序列特异性引物扩增技术对1285名无关个体进行HLA-Cw基因特异性分析,并对其分布规律进行统计学分析。结果共检测到23种HLA-Cw位点的等位基因,其中HLA-Cw*01、*03、*07、*08为主要基因型,其基因频率分别为0 .1529、0 .2385、0 .1747、0 .1004 ,并检出HLA-Cw*12、*14、*15、*16、*17等血清学方法不能鉴定的HLA-Cw基因;统计结果表明HLA-Cw位点的基因分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=73 .74 ,df=98 ,P>0 .5)。结论本研究结果为中国汉族人群提供了一套较为完整HLA-Cw基因遗传学参数。

HLA-Cw位点低分辨基因分型“纯合子”的等位基因特性研究

目的研究HLA—Cw位点低分辨基因分型“纯合子”的等位基因特性，为临床移植配型提供精确资料。方法在43例血缘关系造血干细胞移植（HSCT）供受者中，对中国最常见的低分辨基因分型Cw＊03和Cw＊07的“纯合子”个体采用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR—SSP）高分辨基因分型方法进行等位基因定型，并采用自主研制的三维结构匹配软件系统（HLA Stnic Markversion 1.0）对其等位基因产物进行三维结构匹配，以预测不同分辨率分型结果对移植物抗宿主病（GVHD）发生的影响。结果低分辨基因分型Cw＊03、Cw＊07“纯合子”个体的高分辨基闵分型结果显尔Cw＊03及Cw＊07的纯合子分别为14％和43％，其余均为Cw＊03及Cw＊07杂合子个体。可见其低分辨基因分型易造成供受者间等位基因的错配；在有家系校正的情况下，标本的低分辨模糊结果可以通过家系遗传分析来校正定型；在无家系校正的情况下，应通过高分辨基因分型来确定等位基因，三维结构差异分析则显示这些错配有可能造成HSCT后GVHD的发生。结论当低分辨基因分型结果只出现Cw位点“纯合子”时，有家系的标本应当以家系分型结果校正定型，无家系校正的标本应当用高分辨基因分型方法进行核实，从而为临床移植提供棒确的配型报告，以防止无关供-受者HSCT后因等位基因错配而引起的严重GVHD。

HLA-I类PCR-SSP基因分型在异基因造血干细胞移植中的应用

目的 提高异基因造血干细胞移植供、受者HLA I类配型的精确度 ,有效防止移植物抗宿主病 (GVHD)的发生。方法 采用准确、简便的DNA、RNA提取方法和HLA I类PCR SSP基因分型方法。建立HLA A33、A6 8、B40、B13PCR SSP分型方法以及HLA基因序列测序分析。结果 对 30 0例中血清学难以判断结果的 30例临床标本进行基因水平的研究发现 ,DNA及RNA提取方法可以满足此项研究对样本的要求。HLA I类PCR SSP分型方法具有良好的稳定性、可靠性和特异性 ;重复率达 10 0 %。同时 ,HLA A33、A6 8、B40、B13结果与HLA I类PCR SSP分型结果一致。HLA基因测序分析进一步肯定了HLA I类PCR SSP分型的特异性。HLA I类PCR SSP不受某些血清学影响因素的干扰。整个实验过程仅耗时 2 .5h。结论 HLA I类PCR SSP基因分型方法准确、特异、重复性好 ,可作为临床骨髓移植配型和正常人群无关供者筛选的常规方法 。

我国大陆人群HLA新等位基因发现的现状及应注意的问题

人类对白细胞抗原（human leucocyte antigen,HLA）系统的发现、认识与应用已近半个世纪,对该系统的不断深入揭示,已极大地推动和改观了基础免疫学、器官移植、骨髓库／脐血库人类遗传学、法医学、肿瘤免疫学、肿瘤疫苗学、自身免疫疾病和传染性疾病遗传易感性等诸多学科的落后局面。

新型重组IL-6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白复性及纯化

目的 :对高效表达的重组IL 6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白进行包涵体的分离、变性与复性以及纯化。方法 :对表达菌体进行超声破碎、洗涤、氧化还原法变性及复性 ,经离子交换层析。结果 :工程菌HB10 1/ pE0 1T的表达产物是以包涵体形式存在 ,菌体的破碎以高渗蔗糖溶液进行预处理后 ,再超声破碎效果最好 ;包涵体的洗涤则先用Triton X 10 0洗 2次 ,再用 8mol/L尿素洗涤一次效果更优 ;最佳变性条件为在 7mol/L盐酸胍中加入0 .0 6 5mmol/L的DTT和 0 .2mol/L的盐酸精氨酸 ;最佳复性条件为在 10℃复性保持 2 4h ,蛋白浓度保持在 30～80 μg/ml,并需加入 0 .2mol/L盐酸精氨酸 ;利用谷胱甘肽的氧化还原法 ,当氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的浓度比在 2∶1时所获得的活性成分得率最高 ;利用强弱离子交换结合的方法能获得纯度为 95 %的目的蛋白 ,所得融合蛋白可与IL 6及PEA抗体相结合并能特异性地杀伤高表达IL 6R的人多发性骨髓瘤细胞。结论 :本研究获得重组IL 6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白包涵体的分离、变性与复性条件和一条能获得大量高纯度该融合蛋白的纯化路线。

HLA-DRB1高分辨基因分型在造血干细胞移植中的意义探讨

目的 探讨造血干细胞移植中进行供 受体HLA DRB1高分辨基因分型的重要作用 ,并对HLA DRB1等位基因频率在中国人群中的分布进行分析。方法 采用美国莱姆达公司提供的微量SSPTMHLA DRB1PCR SSP低分辨及高分辨分型试剂盒对 10 1例造血干细胞移植供 受体进行高分辨基因分型 ,其中供 受体 37对 ,无关个体 5 0例。结果 在 37对供 受体分型中 ,有 2对为低分辨HLA DRB1位点相合 ,而高分辨结果为不合 ,其余 35例低分辨及高分辨结果一致。对 5 0例无血源关系供体的HLA DRB1位点高分辨结果进行了等位基因频率分析 ,发现DRB1 0 90 12、DRB1 12 0 2 1/0 2 2、DRB1 0 70 1、DRB1 0 30 11、DRB1 15 0 11/0 12出现频率比较高 ,其频率分别为 36 %、2 2 %、2 0 %、12 %、12 %。结论 HLA DRB1高分辨基因分型分辨率高 ,可明确判定基因型别 ,对于同胞间或无关供