IL-10_(23-57)-PE40分泌表达的初步研究

将IL-1023-57-PE40基因与pelB信号肽融合置于pET-20b构建分泌表达质粒pET-20b-IL-1023-57-PE40,然后将pET-20b-IL-1023-57-PE40分别转化至BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Rosetta(DE3),E·coliK12TB1,ER2566中。无论是在37℃或是在26℃,亦或在培养基中添加葡萄糖的情况下,IPTG诱导后,IL-1023-57-PE40蛋白只在BL21(DE3)pLysS菌中以可溶分泌形式表达,其中以37℃时培养基中不添加葡萄糖表达量为最高,占菌体蛋白总量的15%,说明蛋白的分泌表达与菌种的选择有关。表达产物经免疫印记检测可被抗PE40的特异抗体识别。通过质粒稳定性实验证明,pET-20b-IL-1023-57-PE40在BL21(DE3)中不稳定,导致蛋白的不表达,在Rosetta(DE3)BL21,E·coliK12TB1,ER2566中稳定但不表达,因此,以Rosetta(DE3)BL21为例,通过SDS-PAGE、DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对本室构建的几种PE重组毒素进行比较分析,我们发现:并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,PE重组毒素分泌表达还可能与导向部分的性质有关。

公路沥青路面动态弯沉与静态弯沉关系研究

动态弯沉和静态弯沉是由不同测定方法而派生出的两类弯沉名词。目前国内多数弯沉评定标准的建立均以贝克曼梁弯沉仪所检测的静态弯沉为基础,而落锤式弯沉仪检测的动态弯沉必须经过转化成为静态弯沉后才能融入到路面调查的数据分析中。该文采用最小二乘拟合曲(直)线法,在选择路段上采集动态弯沉和静态弯沉数据,分析二者在数值上的关系,可应用于工程实际。

特异性溶瘤腺病毒调控肺癌细胞表达PD-L1及诱导凋亡的研究

目的:探究特异性溶瘤腺病毒(Ad-Mock、Ad-T)对肺癌细胞上PD-L1表达的调控作用及对细胞凋亡的影响。方法:采用荧光定量PCR法及Western blot检测溶瘤腺病毒在24 h和48 h对NCI-H446、NCI-H226、A549细胞表达PD-L1的影响;通过结晶紫染色、WST-1、Hoechst与JC-1法检测溶瘤腺病毒对肺癌细胞的凋亡抑制作用。结果:特异性溶瘤腺病毒在24 h和48 h均可抑制肺癌细胞表达PD-L1,抑制情况为Ad-T>Ad-Mock,且PD-L1表达量与作用时间呈负相关;溶瘤腺病毒对3种肺癌细胞均具有抑制作用并通过降低线粒体膜电位的方式诱导细胞凋亡,且抑制效果为Ad-T>Ad-Mock,抑制作用与时间呈正相关。结论:特异性溶瘤腺病毒可以抑制肺癌细胞PD-L1的表达并可诱导肺癌细胞的凋亡,对肺癌细胞具有抑制作用。

犬细小病毒四川株的分离与鉴定

为更好地了解我国细小病毒流行情况,笔者从四川农大动物医院采集5份患出血性肠炎犬的粪便,通过猫肾细胞(F81)传代培养后,成功分离到两株犬细小病毒。对两株病毒进行病毒形态学、理化学、血凝试验、PCR鉴定与分子生物学系统鉴定后,证实分离株是犬细小病毒,通过VP2结构蛋白测序分析表明,新分离到的两株细小病毒抗原型分别属于CPV-2a和CPV-2b。

山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法的建立

目的在mRNA水平对山羊Th1/Th2型细胞因子进行定量分析,建立山羊Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量检测方法。方法根据GenBank山羊Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子基因保守序列设计引物,以标准阳性质粒为模板分别进行荧光定量PCR反应的标准曲线、溶解曲线建立。结果山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R^2均大于0.985,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰;利用N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒(△N1L株)与山羊痘AV41株感染山羊外周血淋巴细胞进行IL-4和IFN-γmRNA表达水平检测,△N1L株与山羊痘AV41株均能能够刺激机体IL-4和IFN-γ细胞因子,但二者差异无统计学意义(t=3.333,P>0.5)。结论本研究建立山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测,为山羊痘基因工程疫苗的研究奠定基础。

伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因的克隆

目的 探讨克隆伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因ltb_fap的方法。方法 采用PCR方法扩增伴放线放 线杆菌菌毛相关蛋白(Fap)和大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(Ltb)的融合蛋白基因ltb_fap,NcoⅠ EcoRⅠ双酶切 载体pET28a(+)及ltb_fap基因,连接形成重组质粒pETltb_fap,转化至大肠杆菌DH5α,扩增后提取质粒pETltb_fap进 行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果 本实验扩增的ltb基因约为303bp,fap基因约为228bp,融合基因约为 531bp。重组质粒含外源基因片段约为531bp,酶切鉴定可得到一条约531bp带,DNA测序结果表明与GenBank中 的fap基因序列有97.4%的同源性。结论 成功克隆出融合蛋白基因ltb_fap,为进一步进行蛋白表达、制备抗体奠 定基础。

放线共生放线杆菌菌毛重组蛋白的提取及纯化

目的:对大肠杆菌表达的放线共生放线杆菌菌毛重组蛋白LTB-FAP进行提取和纯化,为其用于牙周病的治疗提供理论依据。方法:将重组质粒pET28a/LTB和pET28a/LTB-FAP分别转化到大肠杆菌中进行表达,通过超声裂解法获得以包涵体形式表达的重组外源蛋白LTB-FAP;用2,4,6和8mol·L-1尿素缓冲液对重组蛋白进行洗涤、溶解;然后用阴离子交换和凝胶过滤柱层析对重组蛋白进行纯化,采用薄层扫描仪对蛋白纯度进行测定。结果:目的包涵体蛋白经过3次4mol·L-1尿素洗涤,6mol·L-1尿素溶解后,经薄层扫描可获得纯度为60%的目的蛋白;经离子交换层析纯化,蛋白纯度可达约75%;Sepharose 6B行凝胶过滤层析获得了纯度可达90%的重组蛋白LTB-FAP。结论:阴离子交换和凝胶过滤柱层析的方法可提取、纯化重组蛋白LTB-FAP,获得的LTB-FAP可以用于免疫机体。

山羊IL-1β IL-8和Mx1因子实时荧光定量检测方法的建立

根据GenBank羊炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)和Mx1保守序列,设计特异性引物,利用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量检测方法。将羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子基因保守区域克隆到pMD18-T载体,构建标准质粒。分别以标准质粒为模板建立荧光定量PCR反应的标准曲线、熔解曲线。结果表明,羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R^2均大于0.990,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰。应用所建立的方法对山羊痘病毒AV41感染山羊外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-8和Mx1 mRNA表达水平进行检测,山羊痘病毒AV41可以刺激机体产生较高的炎性细胞因子。建立的羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子荧光定量检测方法,可以为山羊痘病毒感染后分子免疫机制研究奠定基础。

携带凋亡素基因的溶瘤腺病毒ATV对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用

目的:探讨携带凋亡素基因(apopptin)的溶瘤腺病毒ATV感染对人宫颈癌HeLa细胞自噬和凋亡的影响。方法:分别用携带凋亡素基因的溶瘤腺病毒ATV与对照病毒Ad-MOCK(均为前期工作构建)感染HeLa细胞后,应用WST-1法检测ATV感染对HeLa细胞增殖的影响,流式细胞术检测ATV感染对HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响,Western blotting法检测ATV感染对HeLa细胞自噬相关蛋白LC3、P62与mTOR表达的影响,MDC染色法检测ATV感染对HeLa细胞自噬水平的影响。结果:ATV感染后抑制HeLa细胞增殖,并具有一定的时间效应关系;以ATV 100 MOI感染72 h后抑制率达到59.26%,其抑制能力明显强于同时间段对照组(P<0.01)。ATV感染48 h,ATV组HeLa细胞凋亡率显著高于对照组[(38.995±4.009)%vs(14.680±1.174)%,P<0.01]。感染后的HeLa细胞,随着ATV作用时间的延长,S期出现阻滞,48 h阻滞最强,显著高于对照组[(58.490±2.447)%vs(43.235±4.419)%,P<0.05]。与对照组相比,ATV感染HeLa后,LC3表达量6、12 h逐渐增高,12 h达到最大值(P<0.01),24 h表达量最低(P<0.01);P62蛋白在24 h出现最高表达水平(P<0.01);而mTOR随着作用时间延长逐渐降低(48 h时,P<0.01)。荧光显微镜下可见HeLa细胞核周区域MDC阳性染色,随着ATV作用时间延长,自噬小体明显增多;与对照组相比,6、12h自噬小体数量显著增多[(28.000±2.828)vs(8.500±2.121),(37.000±4.243)vs(14.000±1.414);均P<0.01],24 h相对减少[(12.000±2.828)vs(17.000±1.414),P<0.01]。结论:携带凋亡素基因的ATV溶瘤腺病毒可促进人宫颈癌HeLa细胞的凋亡和自噬水平,进而特异性杀伤肿瘤细胞。

猪德尔塔冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析。结果显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×10^(1)~6.26×10^(8)copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×10^(1)copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0%;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6%。结果表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础。

寨卡病毒SYBR GreenⅠreal-time PCR方法的建立及应用

为建立一种针对寨卡病毒的快速诊断方法,本研究根据寨卡病毒的3’端保守基因序列,设计合成1对引物,建立了检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法。结果显示:所建立的检测方法的Ct值与标准品在1.41×10^1~1.41×10^10^ copies/μL具有良好的线性关系,相关性为1,斜率为-3.502;灵敏性结果显示,该方法的检测限度为1.41×10^1 copies/μL,是普通PCR的10000倍;特异性结果显示,对CHIKV、DENV和JEV无特异性扩增,特异性强;重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于1%,重复性好。本研究建立的SYBR Green I real-time PCR检测方法,可用于寨卡病毒感染的快速诊断。

鹅源禽痘病毒在鸡胚中的增殖及其理化特性鉴定

为填补国内外水禽源痘病毒培养特性和理化特性研究方面的空白,对国内检测并鉴定的鹅源禽痘病毒,用鸡胚进行分离培养和病毒理化特性研究。将鹅皮肤痘疹样本研磨后,接种SPF鸡胚进行连续传代培养。病理检查和PCR检测证实,病毒可在鸡胚中增殖,且经连续5轮传代后,鸡胚病变及病毒滴度趋于稳定。鸡胚中可以观察到绒毛尿囊膜水肿增厚及白色痘斑等禽痘特征性病变。对采集病变的绒毛尿囊膜进行电子显微镜观察,可见病毒包涵体和典型禽痘病毒粒子。利用建立的鸡胚培养体系,对该病毒理化特性进行鉴定,发现病毒对热(55℃)、酸(pH3)、碱(pH11)、胰蛋白酶、乙醚和氯仿敏感。本研究首次建立了鹅源禽痘病毒鸡胚培养体系并对其理化特性进行了鉴定,从而为系统开展该病毒生物学特性和防控技术研究提供了必要的技术基础。

重庆地区犬圆环病毒检测及序列分析

本试验旨在调查近年来新发的犬圆环病毒(canine circovirus,CCV)在重庆地区的流行情况,探索重庆流行毒株的特性。本研究利用PCR方法对2017年采集于重庆地区的100份犬血清样品进行CCV核酸检测,对所得CCV阳性样品进行全基因组扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 6.0和RDP4等软件对分离到的重庆CCV毒株进行分析。结果显示,重庆地区100份犬血清中共有4份为CCV阳性,阳性率为4%,从4份阳性样品中共获得3株不同的CCV基因组(CQ76、CQ79和CQ82),全长基因组序列均为2062 nt,与此前报道长度为2063 nt的CCV基因组相比缺少了一个碱基,该碱基位于5′-基因间隔区内茎环结构的下游。3个毒株的两个ORF之间5′末端间隔区和3′末端间隔区长度分别为134(1929-2062 nt)和203 nt(913-1115 nt)。CQ76、CQ79和CQ82的同源性在99.8%~100%之间,其中CQ76与CQ82仅在第2019位点存在同义突变;所获得的3个重庆毒株与国内外报道的其他CCV基因组序列同源性为82.7%~97.1%,其中,ORF2的变异程度大于ORF1。基于病毒ORF2序列和全基因组分别构建NJ进化树中,CQ76、CQ79和CQ82均属于同一亚群,与属于基因Ⅱ型的中国毒株204株遗传距离较近,同源性为96.5%~96.7%。RDP4重组分析发现,CQ76、CQ79和CQ82毒株基因组均为广西毒株204株和388株的重组序列,重组区域坐落于ORF2。本研究为丰富CCV流行病学和遗传进化信息,以及进一步防控研究提供基础数据。

羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α实时荧光定量检测方法的建立

为探讨羊痘病毒感染后机体的凋亡细胞因子mRNA表达水平的变化,深入探讨羊痘病毒免疫机制,本研究设计针对羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α特异性引物,建立羊凋亡细胞因子实时荧光定量方法。分别建立荧光定量PCR反应体系并进行优化。结果表明:Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰。组内变异系数均小于2.00%。本研究建立的羊凋亡细胞因子SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法为凋亡细胞因子mRNA表达水平提供了技术平台。

广西地区犬、猫细环病毒的全基因组序列分析

为了解细环病毒(Torque teno virus, TTV)在广西地区犬、猫中的流行情况,试验利用PCR方法对采集自广西地区的58份犬、猫腹泻样品进行检测,并对阳性样品进行全基因组序列扩增、测定及遗传进化分析。结果表明:犬细环病毒(TTCaV)阳性率为8.57%(3/35),猫细环病毒(TTFeV)阳性率为8.70%(2/23)。成功获得2株TTCaV(GXNN32和GXNN34)和2株TTFeV(GX26和GX27)的全长基因组序列。2株TTCaV全基因组序列与TTCaV参考株cf-TTV10(日本)、GX206(中国)同源性为96.2%~98.5%,与猪源、人和非人灵长类TTV同源性为18.0%~50.8%;2株TTFeV的全基因组序列与TTFeV参考毒株Fc-TTV4(日本)、PRA4(法国)、SH-F1(中国)、TTFeV278(捷克共和国)同源性为92.3%~96.7%,与猪、人和非人灵长类TTV同源性18.3%~52.8%。本研究获得的2株TTCaV和2株TTFeV之间的同源性为33.9%~34.0%。说明本研究获得的TTCaV和TTFeV分别属于辛型细环病毒属(Thetatorquevirus)和庚型细环病毒属(Etatorquevirus),2株TTCaV和2株TTFeV之间的同源性为33.9%~34.0%。犬、猫可感染特定物种TTV,并且基因组大小存在差异。

双特异性溶瘤腺病毒和多柔比星对乳腺癌细胞增殖抑制作用的对比分析

目的:探讨多柔比星和双特异性溶瘤腺病毒(Ad-VT、Ad-T、Ad-VP3、Ad-Mock)对乳腺癌细胞和正常乳腺细胞增殖抑制作用的差异。方法:通过WST-1实验比较多柔比星和Ad-VT、Ad-T、Ad-VP3、Ad-Mock对乳腺癌细胞增殖的抑制率,并比较两种药物对正常乳腺上皮细胞的存活率的影响。通过Annexin V流式术、Hoechst法、JC-1法检测研究溶瘤腺病毒和多柔比星对乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞杀伤作用的影响,并比较其凋亡率差异。结果:4种双特异性溶瘤腺病毒均能有效地抑制乳腺癌细胞的增殖(P<0.05或P<0.01),且抑制效果为Ad-VT>Ad-T>Ad-VP3>Ad-MOCK,抑制作用与时间成正相关。多柔比星也能有效地抑制乳腺癌细胞的增殖(P<0.05或P<0.01),且随着浓度和时间的增加,抑制效果明显增强;但多柔比星对正常的乳腺上皮细胞也有较强的抑制作用,在72 h、5μg/ml条件下抑制率达到80%,而溶瘤腺病毒Ad-VT在72 h对MCF-10A的抑制率为20%。双特异性溶瘤腺病毒诱导乳腺癌凋亡能力随时间的增加逐渐增强(P<0.05或P<0.01),且致凋亡效率为Ad-VT>Ad-T>Ad-VP3>AdMOCK,而诱导正常乳腺细胞凋亡能力较弱。多柔比星诱导乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞凋亡的能力基本相同(P<0.05或P<0.01),且都为0.05<0.5<5μg/ml。结论:双特异性溶瘤腺病毒能有效地抑制乳腺癌细胞的增殖,但对正常的乳腺细胞抑制作用较小,双特异性溶瘤腺病毒具有更好的安全性,为肿瘤的生物治疗提供了新的药物。

山羊关节炎脑炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测山羊关节炎脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)的快速诊断方法,本研究根据CAEV甘肃株Gag基因设计1对引物,并以含有CAEV甘肃株全基因组序列的质粒pUC57-CAEV为模板,建立CAEV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.19×109~1.19×10^1 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997,斜率为-3.74,检测下限为1.19×10^1 copies/μL,且对痘苗病毒、山羊痘病毒均无扩增。重复性试验结果显示,批间与批内变异系数均小于1%,重复性好。本研究首次建立了CAEVGag基因的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法,为CAEV的快速检测和病毒感染预防提供了技术手段。

猪细小病毒7型广西分离株全基因组序列分析

采集2017年中国广西壮族自治区部分地区猪组织样品,并对PPV7的流行情况进行调查分析。采集健康猪和患病猪样品的PPV7感染率分别为66.7%和84%。此外健康猪和患病猪PCV2共感染率分别为51.74%和77.33%。二者的高感染率表明PPV7可能与PCV2感染存在一定关系。随机选取3份PPV7阳性样品进行主要结构基因测序,并进行系统进化分析。结果显示,3份样品中全基因组序列同源性为94.1%~99.6%,NS1基因核苷酸序列同源性为96.0%~100%。cap基因核苷酸序列同源性为93.9%~97.6%。与PPV7参考株相比,NS1基因同源性为94.2%~97.6%,cap同源性为87.4%~95.0%。在3株PPV7全长基因组,其cap基因分别编码474,470及469个氨基酸,而作为参考的PPV742株则编码469个氨基酸,cap基因序列变异导致cap编码区域氨基酸序列的增加。

痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。

登革病毒SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法的建立及应用

为建立灵敏、高效的登革病毒检测方法,本试验拟以包含登革病毒3′端保守序列的质粒pUC57-DENV为模板,建立检测DENV的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在4.88×10^1~4.88×10^9copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.653。最低检测限度为4.88 copies/μL,对照组未出现特异性扩增,所有稀释度的标准品在80.20℃出现特异性熔解峰。组内和组间试验的变异系数均小于1%。本试验建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,可为登革病毒早期检测提供技术支持。