癌相关成纤维细胞的特性及其调控肿瘤进程的研究进展

肿瘤组织是由恶性上皮细胞及其周围的基质细胞微环境形成的复杂混合体。在肿瘤的发生发展过程中,肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用相互影响,其中癌相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境的重要组成部分。CAF不仅促进肿瘤细胞的增殖与转移、肿瘤微血管生成以及耐药性产生,还能抑制机体的抗肿瘤免疫,从而促进肿瘤的恶性进展。本文简要综述癌相关成纤维细胞的特性及其在调控肿瘤发生发展中的作用。

人脐带间充质干细胞复合胶原支架治疗小型猪皮肤缺损的实验研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)复合胶原支架用于小型猪全层皮肤缺损修复的治疗作用。方法在小型猪背部沿正中线两侧切取正方形全层皮肤缺损创面,随机分为两组,每组6个创面,分别给予胶原支架(对照组)及hUC-MSCs复合胶原支架(实验组)治疗。术后连续监测实验动物的生理状况及创面愈合情况,分别于治疗3周及6周切取创面组织进行HE染色,评估创面皮肤损伤修复效果;并通过CK14及Ki67免疫组织化学染色,评估治疗3周后表皮层细胞增殖情况。结果实验组治疗3周后皮肤创面愈合率[(91.25±3.58)%]明显高于对照组[(73.79±5.73)%](P<0.05)。组织学检测结果表明,实验组治疗3周后创面再表皮化速度较对照组显著提高;治疗6周后,实验组新生表皮层结构较对照组完整且厚度均一,并可见类似正常皮肤的表皮钉突及真皮乳头结构。免疫组织化学分析显示,治疗3周后,实验组表皮层细胞CK14呈强阳性表达;实验组表皮基底层细胞Ki67阳性率[(35.03±6.46)%]较对照组[(2.07±1.07)%]显著提高(P<0.01),表明实验组表皮层细胞增殖活跃。结论hUCMSCs复合胶原支架能显著促进小型猪全层皮肤缺损再表皮化,提高创面愈合速度,为后续开展临床应用研究奠定了基础。

抗GPC3/NKG2D双特异性融合蛋白的制备及其功能研究

目的:构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC3)和NKG2D的双特异性融合蛋白,并初步评价其在体外对肝癌细胞的杀伤功能。方法:通过基因工程技术,将NKG2D的配体人主要组织相容性复合物Ⅰ类相关蛋白A(MHC classⅠchain-related A,MICA)胞外区融合到Fab形式的抗人GPC3抗体GC33的重链末端,构建双特异性融合蛋白(Fab GC33-MICA,FabGM)表达载体;转染FreeStyle;293-F细胞,收集细胞培养上清,经亲和纯化获得FabGM蛋白;利用分子相互作用技术(Fortebio)和流式细胞术检测FabGM的靶向亲和力;细胞实时动态成像分析系统测定FabGM介导的外周血单个核细胞(PBMCs)对高表达GPC3的人肝癌细胞HepG2的杀伤效应,ELISA法检测杀伤过程中PBMCs分泌人干扰素-γ(hIFN-γ)情况。结果:本研究成功地表达并纯化了FabGM,明确FabGM可特异性结合GPC3和NKG2D。经检测FabGM能有效介导PBMCs靶向杀伤HepG2肝癌细胞,诱导PBMCs分泌IFN-γ。结论:双特异性融合蛋白FabGM能够在体外有效介导效应细胞PBMCs杀伤肝癌细胞HepG2,为FabGM成为肝细胞肝癌的潜在靶向治疗药物提供了实验依据。

丝氨酸代谢在脐带血红系细胞增殖过程中的作用研究

目的通过探索氨基酸代谢对红系细胞体外扩增的影响,为提高脐带血红系细胞体外扩增的效率以制备大量的红系细胞奠定基础。方法高效液相色谱法(HPLC)测定脐血单个核细胞(MNC)中造血细胞向红系细胞分化及增殖过程中培养基内氨基酸的消耗情况,筛选出消耗多的氨基酸;进一步选择人脐带血来源的红系祖细胞系(HUDEP-2)作为研究对象,对其培养体系进行特定氨基酸的缺乏与补加,通过细胞计数、EdU掺入实验结合流式细胞术等方法分析特定氨基酸在红系细胞扩增过程中的作用;向红系培养体系中添加特定氨基酸代谢的抑制剂,进一步评价该氨基酸代谢在红系细胞扩增过程中的作用。结果HPLC法检测发现,红系细胞定向分化及增殖过程中丝氨酸的消耗最为显著。在缺乏丝氨酸的培养体系中,红系祖细胞系HUDEP-2的增殖与存活受到明显抑制,但丝氨酸的缺乏并不影响HUDEP-2细胞表面红系细胞特征蛋白的表达。向红系培养基中添加丝氨酸分解代谢的关键酶抑制剂——丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)抑制剂SHIN1后,发现SHIN1明显抑制HUDEP-2的增殖与存活。结论丝氨酸是维持红系细胞增殖能力的关键氨基酸,其分解代谢产生的一碳单位可能是红系细胞增殖所必需的,该结果为体外进一步提高脐带血红系细胞的扩增效率提供了实验依据。

人胚胎干细胞定向诱导分化为红细胞及其生物学特性的研究

目的探讨人胚胎干细胞(hESC)体外诱导制备成熟红细胞的潜能。方法通过三阶段方案诱导hESC向红细胞分化,并通过流式细胞术检测造血干/祖细胞及红细胞表面标志物的变化,通过细胞染色和形态学分析判断红细胞的成熟程度;用实时定量PCR(qRT-PCR)分析不同时间点关键调控基因和珠蛋白链的表达,并以高效液相色谱法(HPLC)检测诱导所得红细胞(cRBC)不同珠蛋白链的表达量;应用血氧分析仪对诱导所得红细胞的血红蛋白(cRBC-Hb)进行功能分析。结果定向诱导可获得CD235/CD71双阳性>80%的红细胞,细胞具有红系细胞形态和携氧能力,但hESC诱导获得的cRBC中β类珠蛋白的表达以γ-珠蛋白为主,cRBC-Hb氧饱和度为50%时的氧分压(P50)也低于成人Hb标准品检测值。实时定量PCR检测发现,伴随诱导过程胚胎干细胞干性基因表达迅速下调,与造血干细胞自我更新、增殖、分化相关基因SCF、HOXB4、Notch-1、Runx1、WNT5、PU.1和SCL,以及红系定向分化调控基因EPOR、EKLF、GATA1和MYB阶段性开启表达,但调控成人型β-珠蛋白表达的EKLF和BCL11A在诱导结束阶段处于较低的表达水平。结论 hESC在体外能向红系诱导分化,关键调控基因程序化地表达,hESC具有体外制备功能红细胞的潜能,但现有的诱导体系获得的cRBC类似于胎儿红细胞。

逆转录病毒介导的稳定表达E4orf1和绿色荧光蛋白的胎肝窦内皮细胞株的建立

目的:为构建优化的内皮细胞用于造血干细胞(HSCs)的支持培养,通过逆转录病毒载体系统建立稳定表达腺病毒E4区开放读框1(E4orf1)和绿色荧光蛋白(GFP)的人胎肝窦内皮细胞(HFLSECs)株。方法:利用Plat-A细胞将质粒MSCV-N E4orf1和p MX-GFP分别包装为逆转录病毒,共同感染HFLSECs,将原代培养的HFLSECs和转基因的HFLSECs分别在含有0.5、1、2、4μg/m L嘌呤霉素的EGM-2培养基中培养,以测试最适药物筛选浓度,药筛1周后通过流式细胞分选获得稳定转染E4orf1的GFP^+HFLSECs(E4orf1-GFP/HFLSECs)。通过密度梯度离心法从脐带血中分离单个核细胞,利用免疫磁柱分选获得CD34^+造血干/祖细胞(HSPCs),以E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层联合SCF、TPO、Flt-3L等3种基础造血相关因子进行体外扩增和半固体造血细胞集落培养。结果:0.5μg/m L嘌呤霉素在5 d内即能完全杀死HFLSECs,而转基因的HFLSECs可以正常存活,以此药物浓度加压筛选1周,后续通过流式分选GFP阳性细胞,阳性率为90.5%,在E4orf1-GFP/HFLSECs饲养层支持下,人脐带血来源的CD34^+细胞15 d扩增了360倍,是单纯细胞因子悬浮培养组的2.2倍,且扩增后的HSPCs在体外仍具有多种造血集落形成能力。结论:该细胞株的建立将为构建造血干细胞体外培养体系及研究造血细胞的发育分化提供适宜的微环境。

小鼠部分肝切除后肝脏再生机制初探

目的构建小鼠部分肝切除术(PH)后肝脏再生模型,初步探究肝脏再生的启动机制。方法对小鼠行PH手术,分别于术后12、24、36、48、72 h获取肝组织样本,同时设假手术组为对照,对肝组织进行病理、凋亡、BrdU掺入、增殖相关基因表达等检测;对实验组与对照组肝组织的单细胞转录组数据进行生物信息学分析,评估上皮细胞的细胞周期分布,以明确肝脏再生启动的时间;同时解析肝星状细胞(HSC)在再生不同阶段的分泌谱,筛选可能在肝脏再生启动中发挥功能的分泌因子;在体外进行细胞共培养实验,通过实时定量PCR、免疫荧光染色等方法检测HSC对肝细胞增殖的影响。结果成功构建小鼠2/3 PH模型,BrdU掺入检测和实时定量PCR结果显示,小鼠肝脏在PH后的早期基本不增殖,术后36~48 h达到增殖高峰;单细胞转录组分析同样表明大量上皮细胞在PH后48 h进入细胞周期S期;建立了HSC在再生不同阶段的分泌基因表达谱,筛选获得了包括Fgf9等在内的可能参与肝脏再生启动的候选分泌因子集合;进一步体外共培养实验表明人肝星状细胞系LX-2能够促进人肝细胞系THLE-2增殖。结论在小鼠PH后肝脏再生早期,微环境中的HSC分泌了多种促进细胞增殖的因子,且体外培养的HSC能够促进肝细胞增殖,提示HSC参与肝脏再生的启动并可能发挥正向调控作用。

β-拉帕醌联合帕博西尼抑制肝内胆管细胞癌细胞及肿瘤干细胞球的增殖

目的探讨β-拉帕醌以及联合帕博西尼对肝内胆管细胞癌(ICC)细胞、肿瘤干细胞球的抑制作用及其作用机制。方法首先,利用CCK-8和克隆形成实验检测β-拉帕醌单药及与帕博西尼联用对人ICC HuCCT1和QBC939细胞系增殖的影响;其次利用肿瘤干细胞球形成实验检测β-拉帕醌单药,帕博西尼单药及联合用药对人ICC细胞中肿瘤干细胞球形成的影响;进一步应用qRT-PCR和Western印迹检测β-拉帕醌处理组与对照组的肿瘤干性相关基因mRNA和蛋白表达水平的影响。结果β-拉帕醌单药及与帕博西尼联用对人ICC肿瘤干细胞球的形成具有显著的抑制作用,且协同效果更加显著。结论β-拉帕醌联合帕博西尼能够显著抑制人ICC细胞及肿瘤干细胞球的增殖。

敲低微小染色体维持蛋白7对肝癌细胞生物学功能的影响

目的研究微小染色体维持蛋白7(MCM7)在肝癌细胞中的功能及作用机制,建立MCM7低表达的肝癌细胞株。方法构建MCM7基因的p SicoR慢病毒干扰载体,对上述载体进行XbaⅠ和XhoⅠ双酶切和测序鉴定。鉴定正确后,在HEK293T细胞中进行慢病毒包装,并使用40%PEG浓缩后的慢病毒感染肝癌细胞,通过流式细胞术分选得到绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞,扩增后收集细胞进行Western印迹鉴定;利用CCK-8、克隆形成、三维培养、凋亡检测以及细胞迁移实验初探MCM7敲低对肝癌细胞生物学功能的影响。结果双酶切和测序结果表明,p SicoR-shMCM7-GFP质粒构建成功; Western印迹结果表明,MCM7的表达水平在分选后的稳转肝癌细胞株中明显下调;对稳转细胞株的生物学功能进行分析,发现在体外敲低MCM7能抑制肝癌细胞的增殖及迁移能力并促进细胞凋亡。结论敲低MCM7的表达对肝癌细胞的增殖和迁移能力有一定的抑制作用并促进细胞凋亡。

脐带间充质干细胞来源的外泌体有效扩增脐带血CD34^(+)细胞

目的 探讨脐带间充质干细胞外泌体(MSC-Exo)在脐带血CD34^(+)细胞扩增中的作用。方法 采用差速离心法从人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)培养上清中分离提取外泌体,透射电镜观察其形态特征,并采用纳米颗粒跟踪分析技术进行鉴定。利用免疫磁珠分选法从新鲜脐带血中分离获得CD34^(+)造血干/祖细胞(HSPC),接种到24孔板中,在含有干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等细胞因子的StemSpan无血清培养基中,实验组加50μg/ml外泌体,对照组加等体积PBS,分别在培养第6和12天,对HSPC扩增数量计数并进行统计分析;利用流式细胞仪检测2种培养条件下HSPC表面标志的表达情况,并于集落培养12 d后进行造血集落形成实验。结果 脐带血CD34^(+)细胞在培养扩增12 d,实验组细胞扩增数量是对照组的1.88倍,两者差异显著(P<0.01);进一步分析表明,培养至第6和12天,实验组中原始造血干细胞(pHSC)(CD34^(+)CD38^(-)CD90^(+)CD45RA-CD49f^(+))的数量分别是对照组的2.13和3.17倍,差异具有统计学意义(P<0.05);造血集落形成实验显示,集落培养12 d,实验组细胞形成的造血集落数量显著高于对照组,特别是代表原始造血分化潜能的混合系集落形成单位(CFU-GEMM)数量显著提高,是对照组的1.9倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 添加脐带MSC-Exo的无血清培养体系,对HSPC的扩增具有更强的促进能力,并能有效提高扩增产物中pHSC的比例。

外周血单个核细胞诱导为肝细胞样细胞及初步探讨对乙酰氨基酚作用下的细胞损伤反应

目的建立外周血单个核细胞诱导肝细胞样细胞的方法,初步探讨其在对乙酰氨基酚(APAP)作用下的细胞损伤反应。方法流式细胞术和免疫荧光法检测外周血分离的单个核细胞表面标志CD45;针对诱导的肝细胞样细胞,倒置显微镜观察细胞形态,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肝细胞特异性基因细胞色素P450(CYP)1A2、CYP3A4、CYP2C9、白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、肝细胞核因子(HNF)4α mRNA的表达水平;免疫荧光法检测肝细胞标志物AFP、HNF4α、ALB在细胞中蛋白的表达水平,生化分析仪检测肝细胞特有的AFP、ALB、尿素的分泌功能,荧光素酶化学发光法检测肝细胞关键药物代谢酶CYP3A4酶活性;肝损伤药物APAP作用肝细胞样细胞后,比色测定法检测肝细胞损伤指标丙氨酸转氨酶(ALT)。采用t检验与秩和检验比较数据间的统计学差异。结果外周血分离的单个核细胞表面标志CD45表达阳性率约98%,诱导第15天细胞形态出现肝细胞样变化;与分离的单个核细胞相比,CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、ALB、AFP、HNF4α mRNA明显升高,AFP、ALB,HNF4α蛋白表达水平均升高,AFP、ALB,尿素的分泌功能增强;与原代肝细胞相比CYP1A2、CYP2C9、AFP、HNF4α mRNA,CYP3A4 mRNA无降低,ALB mRNA较低,AFP、ALB、HNF4α蛋白在细胞中的表达水平无降低,AFP、ALB,尿素的分泌功能无降低。此外肝细胞样细胞产生了与原代肝细胞相似的CYP3A4酶活性;APAP孵育较不含APAP孵育的肝细胞样细胞会释放更多的ALT;在APAP作用下肝细胞样细胞相比分离的单个核细胞ALT释放增加。结论外周血单个核细胞能诱导为具有肝细胞部分特性的肝细胞样细胞,通过诱导具有了肝细胞关键药物代谢酶CYP3A4活性,肝损伤药物APAP作用下,肝细胞样细胞初步体现了肝细胞损伤时ALT分泌的特征。

RUNX1c及GATA2表达质粒构建及其在肝细胞中表达的鉴定

目的构建含RUNX1c及GATA2基因的表达质粒,探讨水动力转染法能否实现其在小鼠肝中的表达。方法采用PCR方法分别扩增RUNX1c及GATA2基因序列,并分别连入T载体中,通过双酶切、连接反应将2个基因序列分别连入慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中。将含RUNX1c及GATA2基因的慢病毒毒液转染至L-02细胞,通过qPCR方法检测目的基因表达。通过水动力高压转染方法将此两种质粒通过尾静脉注入小鼠体内,于转染24 h,取小鼠肝组织,对组织切片进行抗RUNX1及GATA2抗体的免疫荧光染色;于转染72 h,通过流式细胞术分选肝组织中GFP+细胞,实时定量PCR(qPCR)检测RUNX1c、GATA2及造血相关基因的表达。结果经双酶切及测序鉴定证明,pCDH-MCS-T2A-RUNX1c-copGFP-MSCV、pCDH-MCS-T2A-GATA2-copGFP-MSCV质粒构建成功。通过体外实验证实这两个载体携带的RUNX1c及GATA2基因能在人肝细胞系L-02中表达。水动力高压转染法可使含RUNX1c及GATA2的质粒进入肝组织,并在肝细胞中表达RUNX1及GATA2蛋白。通过分选肝组织中GFP+细胞,可发现这些细胞内过表达RUNX1及GATA2基因,Fli-1、Erg基因的表达也明显提高。结论成功构建了含有造血转录因子RUNX1c、GATA2基因的表达载体,并通过水动力转染法实现RUNX1c、GATA2的表达载体在小鼠肝中的表达,为进一步研究肝中过表达造血转录因子能否实现肝细胞转分化为造血细胞及观察其对造血系统修复的作用奠定基础。