核糖核酸-蛋白质复合物规模化富集与鉴定技术的研究进展

核糖核酸(RNA)在细胞中并非单独存在,从它们产生到被降解的过程中与大量蛋白质发生相互作用,RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)能与RNA结合形成RNA-蛋白质复合物(RP复合物),并以这种复合物的形式发挥生理功能。RNAs或RBPs任一组分的异常与缺失都会影响RP复合物的正常生理功能,从而导致疾病的发生,如代谢异常、肌肉萎缩症、自身免疫性疾病和癌症。因此,定性定量分析RBPs及其在正常细胞和肿瘤细胞中与RNAs靶标之间的复杂相互作用网络有助于挖掘RP复合物在肿瘤发生发展中的作用,开发肿瘤生物标志物和新的治疗方式。要深入研究和理解RNAs与RBPs的相互作用网络,须依赖组学技术对RP复合物进行大规模鉴定。而作为在组学层面系统性解析RP复合物组成、含量和功能的第一步,大规模富集RP复合物极具挑战性。为了解决这一难题,研究者们发展了各种富集鉴定策略。该文针对RP复合物富集策略的最新进展进行了综述,包括紫外光交联和免疫沉淀(crosslinking and immunoprecipitation,CLIP)及其衍生技术、基于“点击化学”的富集策略和基于相分离的富集策略,比较分析了它们的技术原理、优缺点,以方便研究者们选择合适的策略来解决感兴趣的生物学问题。该文最后总结了当前的RP复合物富集方法仍然存在富集效率低和操作繁琐等亟需解决的技术挑战,为富集策略的发展提供了研究方向。

基于深度学习的保留时间预测方法的研究进展及应用

在基于液相色谱-质谱联用的蛋白质组学研究中,肽段的保留时间作为有效区分不同肽段的特征参数,可以根据肽段自身的序列等信息对其进行预测。使用预测得到的保留时间辅助质谱数据鉴定肽段序列可以提高鉴定的准确性,因此对保留时间预测的工作一直受到领域内的广泛关注。传统的保留时间预测方法通常是根据氨基酸序列计算肽段的理化性质,进而计算肽段在特定色谱条件下的保留时间。近年来,深度学习方法取得了极大的进展,在蛋白质组学研究中发挥着越来越重要的作用。目前已发展出了多种基于深度学习的保留时间预测方法,与传统的保留时间预测方法相比有着更高的准确度,易于跨平台使用,并且能对修饰肽段的保留时间进行预测。但对某些复杂的修饰,如糖基化修饰等的预测结果还不够准确。如何进一步提高对修饰肽段预测的准确性是基于深度学习的保留时间预测方法的重要研究方向。这些预测的保留时间被应用于肽段鉴定的质量控制和方法评估,以及与预测的二级质谱谱图结合,建立模拟谱图库等方面。该文综述了深度学习方法在保留时间预测领域的最新研究进展以及应用成果,同时对其发展趋势和未来的应用方向进行了展望,以期为保留时间预测研究以及蛋白质组鉴定工作提供参考。

人尿液N-糖蛋白/N-糖肽规模化富集鉴定

蛋白质的N-糖基化是真核细胞中一种重要的翻译后修饰,N-糖基化修饰在调控细胞黏附、迁移、信号转导及细胞凋亡等方面扮演着关键角色。蛋白质糖基化修饰的异常变化与多种重要疾病的发生相关。尿液具有蛋白质组复杂程度低和非入侵性等特点,适合大量及连续多时间点采样研究。但由于个体差异和生理条件的影响,尿蛋白丰度的生理波动较大。目前缺乏对健康人群尿液N-糖蛋白的个体差异和生理波动的专门性研究,以及生理丰度范围的构建,难以将个体差异、正常生理波动和疾病导致的变化进行有效区分,对疾病标志物研究提出很大挑战。本研究以亲水相互作用色谱法(HILIC)为基础,对该富集方法中活化、清洗与洗脱过程进行优化,其中主要对HILIC填料粒径和富集缓冲体系进行优化,并考察了不同实验条件下N-糖肽富集的鉴定数量、选择性与稳定性,发现当HILIC填料粒径为5μm,在三氟乙酸富集体系下有更高的N-糖蛋白/N-糖肽鉴定水平。在此基础上,对20例健康男性志愿者和20例健康女性志愿者的尿液N-糖蛋白/N-糖肽进行了富集和定性、定量及功能分析。从40例尿液样本中共鉴定到1016个N-糖蛋白、2192条N-糖肽。采用非标定量策略对尿液N-糖肽的生理丰度波动范围进行了考察,尿液N-糖肽的丰度跨度约5个数量级。在此之后探索了健康人群尿蛋白N-糖基化水平的性别差异,筛选出性别相关的差异N-糖蛋白后进行了功能分析。统计学分析显示在尿液样本中性别可能是产生个体差异的重要因素。该工作为基于尿液糖蛋白质组学的功能与机制研究和临床生物标志物筛选提供了有力支撑。

TLR5信号通路对肝脏免疫状态的影响

目的探讨TLR5信号通路对肝脏免疫微环境的调控作用。方法检测外源性TLR5信号活化时(C57BL/6小鼠注射TLR5激动剂CBLB502蛋白)和内源性tlr5基因缺失(tlr5-/-)时小鼠外周血象的变化、血清转氨酶的水平、肝内趋化因子mRNA的水平及肝内免疫细胞的比例。结果 TLR5信号活化后外周血白细胞、中性粒细胞数目显著上升,淋巴细胞、红细胞、血红蛋白和血小板数目显著下降;肝内中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞和自然杀伤细胞的比例显著增加,血清转氨酶水平未见升高;肝内CCL2、CCL7、CXCL1和ICAM-1 m RNA水平均显著上调。与野生型相比,tlr5-/-小鼠外周血中性粒细胞数目显著增加,血小板数目显著降低;肝内中性粒和树突细胞比例显著增加,CD4+T细胞的活化增强,血清转氨酶水平略有升高,肝组织病理分析未见异常;肝内CCL2、CCL3、CXCL1、IL-1β、TNF-α和IFN-γmRNA水平显著上调。结论 TLR5信号通路对肝脏免疫状态具有调控作用,对其功能的合理调节有利于肝脏炎性疾病的防治。

半胱氨酸氧化还原修饰组分析:进展与展望

半胱氨酸巯基上的氧化还原修饰能够可逆、可控地调节蛋白质活性、互作与定位,进而实现对诸多生物学进程与信号通路的精细调控.在蛋白质组层面上分析此类修饰位点及其动态转换有助于系统描绘并解析氧化还原调控网络.近年来,随着化学选择性标记试剂的不断涌现,质谱技术的升级换代,氧化还原修饰组分析的覆盖度与通量均得以极大提升,为氧化还原生物学研究提供了有力的研究工具与丰富的数据资源.本文从技术发展的角度,评述了目前常用的氧还蛋白质组技术类型及其优缺点、应用场景,介绍了此类数据驱动的若干科学发现,展望了未来拟突破与待拓展的方向.

基于三甲基苯磺酰羟胺消除反应的氧连接氮乙酰葡萄糖胺修饰肽段的精准鉴定

氧连接氮乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它在维持机体正常的生命活动中发挥着重要作用。许多研究证实,O-GlcNAc糖基化修饰稳态的破坏与人类多种疾病的发生相关,大规模富集鉴定O-GlcNAc糖基化修饰蛋白有助于发现新的临床疾病诊断标志物。由于O-GlcNAc糖基化修饰丰度较低,形成的糖苷键不稳定,O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定面临一定挑战。近年来,全乙酰化的非天然糖代谢标记技术被广泛应用于O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定。然而,最新的研究发现,在细胞代谢标记过程中,全乙酰化的非天然单糖会同时标记半胱氨酸的巯基而引入半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物。该副反应在一定程度上干扰了O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定。鉴于此,研究发展了一种通过三甲基苯磺酰羟胺(MSH)特异性氧化消除半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物的方法,进而显著提高O-GlcNAc糖基化修饰肽段的精准鉴定。该方法建立于温和的磷酸钠缓冲液(50 mmol/L,pH=8)体系,利用过量的MSH,于95℃避光振荡反应30 min,可完全消除半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物。该方法应用于Hela细胞中,可有效消除叠氮全乙酰化半乳糖胺(Ac4GalNAz)代谢产生的半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物,从而成功富集鉴定到157条O-GlcNAc糖基化修饰肽段,归属于130个蛋白质。该方法有效去除了半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物对代谢标记结果的干扰,为非天然糖代谢标记技术在糖蛋白组学分析中的应用提供了新的研究策略。